精品論文，值得推薦熒光偏振和多重聚合酶鏈技術(shù)在肺炎支原體、肺炎衣原體檢測中的應(yīng)用 作者：姜怡王玲伍雪艷閆小君董秀珍 【摘要】 目的: 應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)和熒光偏振檢測技術(shù)建立一種方便可靠、簡單經(jīng)濟的肺炎支原體、肺炎衣原體DNA同步檢測方法. 方法: 以與肺炎衣原體、肺炎支原體16SRNA序列互補的特異、無交叉反應(yīng)的兩對引物在同一反應(yīng)體系中行多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增陰陽性對照及521例患兒咽喉分泌物，將熒光偏振檢測技術(shù)與模板指導(dǎo)的DNA末端延伸反應(yīng)（TDI FP）結(jié)合，對樣本PCR擴增產(chǎn)物進行進一步檢測，并與測序方法結(jié)果比較. 結(jié)果: 應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)和TDI FP技術(shù)檢測患者521例，肺炎衣原體感染陽性121例，肺炎支原體感染陽性113例，與測序檢測方法符合率100%，其中肺炎衣原體、肺炎支原體雙重感染陽性10例. 結(jié)論: 建立了基于熒光偏振技術(shù)檢測肺炎衣原體、肺炎支原體的新方法，具有良好的特異性,方便簡單,無需標(biāo)記探針,可用于臨床檢測. 【關(guān)鍵詞】 肺炎衣原體；肺炎支原體；熒光偏振；多重聚合酶鏈反應(yīng) 【Abstract】 AIM: To develop a simple，economical，accurate and practical method for the detection of Mycoplasma pneumoniae (MP) and Chlamydia pneumoniae (CP) using Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization （TDIFP） and a multiple PCR. METHODS: Twopair primers of MP and CP were used to amplify DNA of positive and negative controls and 521 samples by a multiple PCR, then the PCR products were identified by TDIFP：MP and CP specific probe hybridization and special fluorogenic label ddNTP incorporation. A fluorogenic ddNTP was directly added to the end of probe under the direction of template. The results were measured by a fluorescencepolarization microplate reader and compared with the results of sequencing. RESULTS: There were 113 patients infected with MP, 121 patients infected with CP, 10 with double infections. Compared with the results of sequencing, the results measured by TDIFP showed an excellent overall agreement when single infection was taken into account. The proposed method could detect single or multiple infection by a multiple PCR, but DNA sequencing method was limited. TDIFP method reached the detection level (10 copies) and the data of FP values showed excellent reproducibility. CONCLUSION: The proposed method allows a sensitive, special, simple and economical detection of MP and CP by a multiplePCR without any use of label probes. It is expected to be an extremely useful tool in clinic. 【Keywords】 Mycoplasma pneumoniae; Chlamydophila pneumoniae; fluorescenc polarization, multiple PCR 0引言 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, CP)是引發(fā)呼吸道感染的常見病因，患者的起始癥狀及胸部X線特征與其他病原體特別是SARS病毒引起的呼吸道感染極其相似而易誤診. 因此，及早快速準(zhǔn)確地檢測MP,CP感染，對鑒別診斷和預(yù)防控制相關(guān)疾病非常重要1-2. 我們采用熒光偏振檢測與模板指導(dǎo)的末端延伸反應(yīng)檢測技術(shù)相結(jié)合（TDIFP）的方法，建立了在同一反應(yīng)體系中應(yīng)用多重引物，同步檢測MP,CP感染的方法. 1材料和方法 1.1材料 標(biāo)本采集于在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院、西京醫(yī)院、西安交通大學(xué)第二醫(yī)院兒科的就診患者521例,在24 h內(nèi)未使用任何抗生素. 用無菌咽試子插入咽喉處旋轉(zhuǎn)涂抹, 停留1 min后取出試子重懸于500 L PBS中，置于-20備檢. pGEMTEasy Vector System TA Cloning試劑盒(Promega Corporation公司)，BigDye Terminator Cycle Sequenceing試劑盒、ABI 377（美國AB公司），ddGTPR110/ddCTPTAMRA,核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶、熒光偏振檢測儀（美國Perkin Elmer公司）. 含CP，MP保守區(qū)基因質(zhì)粒由本研究所提供. DNA引物及探針由上海博亞公司合成，據(jù)GenBank基因序列及引物合成原則選取CP(CP 16S ribosomal RNA)，MP(MP 16S ribosomal RNA)保守區(qū)序列設(shè)計各自特異、互不交叉的引物、探針及摻入堿基，擴增片段長度分別為160, 275 bp. CP：引物5 tatttgacaactgtagaaatacagc 3， 5 ttagagttccccaccctaagtgctggc 3，探針5 cgcaaggacagatacacaggtgctgcatgg 3，摻入堿基ddCTPTAMRA，MP：引物5 aaaggacctgcaagggttcgttat 3，5 ctctagccattacctgctaaagtc 3，探針5 agtagaatagccacaatgggactgacac 3，摻入堿基ddGTPR110. 1.2方法 1.2.1DNA的提取及多重PCR擴增將分泌物在500 L PBS中反復(fù)震蕩洗滌擠干，12 000 g離心2 min, 棄上清， 沉淀震蕩重懸于200 L PBS中， -20反復(fù)凍融3次, 煮沸, 12 000 g離心5 min, 留上清作模板. 取DNA模板5 L，擴增靶片段DNA. 擴增條件：dNTP 150 mol/L，引物各20 pmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L. 94 5 min變性, 94 1 min，50 2 min, 72 5 min，30個循環(huán). 含CP，MP16SRNA基因質(zhì)粒DNA混合物為陽性對照，不含待測靶基因的同源質(zhì)粒DNA為陰性對照. 1.2.2PCR擴增產(chǎn)物的分析采用CP,MP特異序列雜交與模板指導(dǎo)的末端堿基摻入延伸反應(yīng)（TDIFP）對擴增產(chǎn)物分析. PCR產(chǎn)物與核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶37孵育1 h，消化剩余的引物和dNTP，95 15 min滅活酶活性. 然后以此產(chǎn)物為模板，分別以CP,MP特異探針及標(biāo)記的ddGTPR110/ddCTPTAMRA為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中于95 2 min, 95 15 s，45 30 s,25個循環(huán)，特異序列雜交并引導(dǎo)模板指導(dǎo)的末端堿基ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入延伸反應(yīng)(圖1)，分別于波長535,595 nm 檢測R110,TAMRA摻入熒光偏振值（mp）. 1.2.3敏感性測定以10倍比例分別將CP,MP陽性對照的質(zhì)粒倍比稀釋直至10ag(1拷貝)，PCR擴增，產(chǎn)物進行TDIFP法分析判讀. 1.2.4重復(fù)性測定分別對陰陽性對照及521例標(biāo)本的熒光偏振值重復(fù)檢測10次，觀察FP變化. 1.2.5與測序方法對比應(yīng)用試劑盒將隨機抽取TDIFP檢測CP,MP陽性各50例標(biāo)本PCR產(chǎn)物連接至pGEMTEasy質(zhì)粒載體中，測定插入片段的DNA序列，在NCBI BLAST2.0中確定所測序列，并與TDIFP方法檢測結(jié)果比較. 統(tǒng)計學(xué)處理： 檢測結(jié)果用SPSS 10.0軟件經(jīng)2檢驗. 2結(jié)果 21TDIFP法檢測檢測陰、陽性對照與標(biāo)本DNA經(jīng)2對引物擴增后，分別與CP,MP的特異探針及熒光標(biāo)記堿基反應(yīng)，分別檢測R110，TAMRA熒光偏振值. 陰性對照無特異的雜交反應(yīng)并ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入，TAMRA，R110值均未增高，CP,MP陽性對照分別與相應(yīng)特異的探針發(fā)生雜交反應(yīng)并ddGTPR110或ddCTPTAMRA摻入，R110或TAMRA值分別增高；TAMRA及R110值均增高, 則CP,MP雙重陽性(表1). 521例標(biāo)本中CP感染陽性121例，MP感染陽性113例，其中CP,MP雙重感染陽性10例.表1對照與標(biāo)本的R110，TAMRA熒光偏振值（略） 2.2敏感性測定對陽性對照質(zhì)粒倍比稀釋的PCR擴增產(chǎn)物進行的TDIFP分析表明，該法敏感度可達10拷貝. 2.3重復(fù)性測定在521例標(biāo)本中，熒光偏振值檢測10次的變化幅度小于10 mp，無統(tǒng)計學(xué)意義. 2.4與測序方法對比50例單純CP，MP感染與測序方法符合率達98% (P>0.05). 3討論 CP，MP是引發(fā)急性呼吸、循環(huán)系統(tǒng)感染的主要病原體，在無實驗室依據(jù)時臨床難以與其他病原進行鑒別3-4. 傳統(tǒng)的抗原檢測易受到采樣、運送、保存、用藥及抗原交叉反應(yīng)等多種因素的干擾. 基因診斷直接檢測臨床標(biāo)本感染病原體的基因, 屬病因診斷，在疾病預(yù)防、診斷及療效考核等各方面都有重要意義5. 經(jīng)典的采用瓊脂糖凝膠電泳等手段對檢測結(jié)果觀察分析，人為誤差大，假陽性、假陰性率高，實時熒光定量PCR檢測技術(shù)需特異標(biāo)記的探針，實驗成本增加，價格昂貴6. 熒光偏振技術(shù)檢測偏振光強度而非熒光強度，靈敏度高，快速、簡單和準(zhǔn)確. TDI反應(yīng)是在DNA模板引導(dǎo)下的引物末端延伸反應(yīng)，通過引物擴增、確定特異探針與靶DNA的識別雜交及在模扳指導(dǎo)下在特定位置特異鹼基摻入三重把關(guān)，決定基因型，從而確保反應(yīng)的特異性7. 我們在一次PCR反應(yīng)體系中加入2對高度特異、互不交叉的CP, MP引物，針對2個靶DNA進行擴增，再利用TDIFP基因檢測技術(shù)，使用2個特異探針及特異末端終止堿基，對PCR產(chǎn)物鑒定，檢測CP, MP，使得對感染的檢測快速、可靠、特異及操作簡單，尤其能降低多重混合感染的漏診率和檢測成本，提高了檢驗效率，與測序檢測方法符合率高, 敏感度高達10拷貝，不失為高通量的、臨床實驗室實用的基因診斷新方法. 【參考文獻】 1陳小友，賈土妹，陳黎勤. 肺炎衣原體和肺炎支原體MP感染與兒童哮喘的關(guān)系J. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006， 18（10）：50-54. 2姚瑩. SARS診斷的鑒別思考J. 中國誤診學(xué)雜志，2005,5(5)：959-960. 3Liu G, Talkington DF, Fields BS,et al. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in young children from China with communityacquired pneumoniaJ. Diagn Microbiol Infect Dis, 2005,52(1):7-14. 4Sinaniotis CA, Sinaniotis AC. Communityacquired pneumonia in childrenJ. Curr Opin Pulm Med, 2005,11(3):218-225. 5Ginevra C, Barranger C, Ros A,et al.Development and evaluation of Chlamylege, a new commercial test allowing simultaneous detection and identification of Legionella, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma pneumoniae in clinical respiratory specimens by multiplex PCRJ. J Clin Microbiol, 20