實驗動物學設計大綱實驗名稱：普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV)感染模型比較 課題來源：自選 設計班級：2004級檢驗本科班 設計人員：羅坤 設計日期：2007年5月26日 指導老師：張曉 陳建敏 成都醫學院實驗技術教研室2007年制一、實驗設計的目的意義：實驗設計的目的意義，國內外研究現狀，存在的問題，解決問題的思路。目的與意義比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點,建立理想動物模型, 為研究發病機理和防治措施奠定基礎。國內外研究現狀人呼吸道合胞病毒( human respiratory syncytial virus, RSV) 是全球嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體, 幾乎所有兒童兩歲前感染過至少一次RSV1,年齡越小病情越重, 再感染率高, 與哮喘發生密切相關2。免疫缺陷者更易感染, 臨床癥狀更為嚴重,常致死亡3。每年住院治療的50%-75% 嬰幼兒毛細支氣管炎和25% 40% 的肺炎是RSV直接引起, 1 歲內嬰兒RSV感染率68.8%, 1-2 歲感染率達82.6%100%。嬰兒期急性RSV 下呼吸道感染使非特應體質和特應體質兒童發生哮喘危險性都比普通兒童明顯增加, 是哮喘的獨立危險因素4雖然已有許多抗RSV 制劑和疫苗的研究, 但尚無安全有效的防治方法。抗RSV 制劑的研究需要建立理想的動物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。肺組織RSV抗原保護性免疫僅能維持數月, 福爾馬林滅活疫苗不能起到保護作用反而加重病情, 至今RSV 仍無安全有效的治療藥物和預防疫苗, 脫氧核酶等新型抗RSV制劑正在研究中, 已在體外無細胞體系和細胞模型中表現抗病毒活性, 需要建立恰當的動物模型, 進一步在體內研究其抗病毒作用5。從RSV 發現至今,已建立的黑猩猩、獼猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有優勢和局限6, 除靈長類動物可出現臨床癥狀, 其他都是無癥狀隱性感染7。BALB/c小鼠為近交繁殖產生，其對多種病原體具有易感性，利用小鼠建立模型的優點是它易獲得, 遺傳背景清楚而均一, 基因改造技術成熟, 已有多種商品化試劑, 是目前應用最廣泛的實驗動物。但小鼠不是RSV 自然宿主, 我們以往實驗發現BALB/c 鼠感染RSV 沒有臨床癥狀, 肺內病毒復制水平相對低, 病毒滴度下降快, 帶毒時間短, 限制了治療效果的觀察8。裸小鼠采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產生，這種無毛小鼠是由于第11號染色體等位基因突變引起的，裸小鼠主要特征是無毛、裸體和無胸腺，缺乏成熟T細胞的免疫功能，B淋巴細胞正常，成年裸小鼠較普通小鼠有較高水平的NK細胞活性，目前未做過裸小鼠RSV感染模型，對其優勢和局限尚不完全清楚。存在的問題：目前雖然已有許多抗RSV 制劑和疫苗的研究, 但尚無安全有效的防治方法，RSV感染具體發病機制也不夠清楚，其發病機制和抗RSV 制劑的研究需要建立理想的動物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。解決問題的思路： 復制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型 ，不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度, 計數支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學改變，比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點。參考文獻：1 BlackCP. SystematicReviewoftheBiologyandMedical Management ofRespiratory Syncytial Virus InfectionJ. Respiratory Care, 2003; 48( 3) :209- 233.2 Holt PC, S1y PD.Interactions between RSV infection, asthma andatopy: unraveling the complexities J. J Exp Med, 2002; 196( 10) :1271- 1275.3 Meissner HC, RennelsMB, PickeringLK, et al.Risk of severe respiratorysyncytial virus disease, identification of high risk infants and recommendationsfor prophylaxis with palivizumabJ.Pediatr Infect Dis J, 2004;23( 3) : 284- 285.4 OddywH, de Merk NH, S1y PD, et a1. The effects of respiratory infections,atopy and breastfeeding on childhood asthma J.Eur Respir J,2002; 19( 5) :899- 905.5 ZhaoC- A,ZhaoX- D,YuH- Get al. Inhibitionofrespiratory syncytialvirus replication in cultured cells by RNA cleaving DNAzyme J.Chin JPediatr, 2003; 41( 8) : 594- 598.6 Schmidt AC, Johnson TR, Peter JM, et al.Respiratory syncytial virusand other pneumoviruses: a review of the international symposium- RSV2003J.Virus Research, 2004; 106 : 1- 13.7 McArthur- Vaughan K, Gershwin LJ.A rhesus monkey model of respiratorysyncytial virus infectionJ.J Med Primatol, 2002; 31( 2) : 61- 73.8 Lian G- L, Yu H- G, ZhaoX- D, et al.Establishment of respiratory syncytialvirus infection model in miceJ. J Xian JiaotongUniversity( MedicalSciences) , 2003; 24( 4) : 329- 332. 二、實驗設計方案（實驗設計目標,擬解決的主要問題, 實驗動物設計,實驗專業設計，實驗統計設計,實驗方法設計，可行性分析,預期結果，實驗設計工作時間安排）。（一）實驗設計目標，擬解決的關鍵問題設計目標比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點,以建立理想動物模型擬解決的關鍵問題BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的復制，對試驗性RSV 感染的模型進行分組與實驗結果分析。（二）實驗設計1、實驗動物設計（主要內容包括：遺傳背景，微生物質量控制，育種繁殖，飼養管理，動物模型，實驗動物學技術）（1）遺傳背景BALB/c鼠遺傳背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遺傳背景：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產生的同源導入近交系小鼠。（2）微生物質量控制BALB/c小鼠微生物質量要求：普通級動物要求。裸小鼠微生物質量要求： SPF（無特定病原體）或無菌要求 （3）育種繁殖BALB/c小鼠育種繁殖：繁殖方法：近交繁殖初始動物的選擇：挑選一對或幾對具有育種目標要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門較遠2、雄鼠生殖器與肛門之間長毛3、雄鼠的生殖器較雌鼠大4、雌鼠乳頭較雄鼠明顯性成熟期：35-55日齡；實配年齡：60日齡左右；成熟時體重：20克以上發情鑒定：動情期小鼠外陰部腫脹紅潤，撫摸其身體出現脊柱前凹、抬臀等行為現象配種：動情前期交配 交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法育種代數：作為親本的全同胞兄妹（初始動物）記為0代，按雌雄1：1進行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對或幾對全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進行交配，以此類推，直到20代以上個體選擇：選擇留繁殖力強，生活力強，特別是目標性狀和基因保種方法：平行線系統擴大繁殖生產方法：交通信號燈方法裸小鼠育種繁殖:繁殖方法：近交繁殖（同源導入近交）初始動物的選擇：挑選一對或幾對具有育種目標要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門較遠2、雄鼠的生殖器較雌鼠大3、雌鼠乳頭較雄鼠明顯發情鑒定：動情期小鼠外陰部腫脹紅潤，撫摸其身體出現脊柱前凹、抬臀等行為現象配種：動情前期交配交配形式：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法，雌雄比例為1：1，有時可采用1：2或1：3妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法（平均每胎所得純合子仔鼠能占仔數的550，離乳率97，14胎生育恒定，一年存活率達100 ，最長生存期可達752 d。）育種代數：作為親本nu+雌鼠與nunu雄鼠記為0代，按雌雄1：1進行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對或幾對全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進行交配，以此類推，直到20代以上個體選擇：選擇留繁殖力強，生活力強，特別是目標性狀和基因保種方法：平行線系統擴大繁殖生產方法：交通信號燈方法（4）飼養管理BALB/c小鼠飼養管理:BALB/c小鼠環境標準：實驗動物飼養室的溫度為18-19，相對濕度為40%-70%，每小時換氣次數為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lxBALB/c小鼠設施：開放系統BALB/c小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，墊料須經高壓蒸汽滅菌BALB/c小鼠飼喂：飼喂小鼠全價營養顆粒飼料，飼料的消毒滅菌應達到相應等級小鼠微生物控制的要求。飼喂采取“少量勤添”的原則，每周喂料3-4次，飲水應保證連續不斷，每周換水2-3次，墊料每周更換1-2次BALB/c小鼠飼養環境衛生消毒：做好室內的清潔、消毒、及飼料籠器具的清洗消毒，每次飼養完后，用苯扎溴銨擦拭籠架、地板，每月定期徹底噴霧消毒1次裸小鼠飼養管理:裸小鼠環境標準：實驗動物飼養室的溫度為18-19，相對濕度為40%-70%，每小時換氣次數為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lx，空氣潔凈度為100000級裸小鼠設施：屏障系統或隔離系統裸小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經過滅菌消毒 裸小鼠飼喂：每周飼喂全價營養飼料23次。飼料、飲水、墊料及鼠籠均用雙層包布包裝高壓蒸汽滅菌消毒。進室前經緩沖室紫外燈照射后去除外層包布，才能進入繁殖室及實驗室裸小鼠飼養環境衛生消毒： 繁殖室設在空氣過濾十萬級環境中放置層流柜作為裸小鼠繁殖飼養條件。啟用前，先用2新潔而滅全面擦拭，然后按消毒區域的容積用高錳酸鉀15 g，In2加福爾馬林15 mL混和熏蒸。最后經紫外燈照射，細菌培養陰性才使用。啟用后我們的常規消毒是：進實驗室前后紫外燈照射30 rain，每2周用2新潔而滅擦拭墻壁、天花板，每一個月用過氧乙酸噴射消毒。每三個月用甲醛和高錳酸甲熏蒸一次(用備用實驗室輪流消毒和使用)。每三個月將層流柜的過濾材料拆下進行清洗。每年更換一次過濾材料。飼養人員定期入繁殖室進行飼養管理操作。進室前需淋浴并用新潔而滅常規泡手、消毒、穿無菌衣、帶襪的無菌褲、戴口罩、帽子。外層穿上手術隔離衣，并帶手術膠手套及無菌紗手套。每次操作完畢，用新潔而滅抹臺面及地面。常規每周換兩次籠具，投放3 4 d的飼料與飲水。每周加兩次雞蛋和瓜子及一次維生素。2、實驗專業設計實驗動物：選用BALB/c鼠和裸小鼠作為實驗動物。處理措施：感染RSV。觀察指標：感染RSV 后不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度, 計數支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學改變3、實驗統計設計結果用均數標準差表示, 兩兩組間比較用t 檢驗, 各組間比較用方差分析。= 0.05,P0.05 認為有顯著性差異。4、實驗方法設計實驗技術路線BALB/c小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠B ：感染3 天的BALB/c 小鼠A ：對照BALB/c 小鼠D ： 對照裸鼠裸小鼠F ：感染6 天的裸鼠E ：感染3 天的裸鼠不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度, 計數支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學改變實驗技術方法（1）隨機抽樣：選正常成年健康體重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分別將30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按體重由小變大編號后，從隨機數字表中查取隨機數字，依次抄錄于小鼠編號下。具體方法：兩種動物編號為130號，30只BALB/c小鼠按照能被3除的規律：不余到A組，余1到B組，余2到C組 ；30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的規律：不余到D組，余1到E組，余2到F組 （2）實驗分組：實驗分六組： A ：對照BALB/c 小鼠 B ：感染3 天的BALB/c 小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠 D ： 對照裸鼠E ：感染3 天的裸鼠F ：感染6 天的裸鼠（3）模型復制:1 .病毒和細胞培養:Hep- 2 細胞接種RSV 標準A2 株病毒, 含2% 胎牛血清( FBS) DMEM培養至病變達90%100%, 吸取培養液, 4, 3000g 離心10min收集上清, - 80儲存備用。2.病毒接種: BALB/c小鼠和無特殊病原菌( specific pathogen free, SPF) 級812 周齡、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉0.06mg/g 麻醉后, 感染組鼻腔緩慢滴入2106PFU/ ml RSV A2 株病毒液50l, 陰性對照組滴入50l 2% FBS DMEM。(4)取材:病毒分離和滴度分析:感染后不同時間處死小鼠, 無菌條件下取左肺、肝臟和脾臟稱重, 按10ml/g( wt/vol) 加入預冷組織平衡液, 勻漿制備肺臟、肝臟和脾臟組織懸液, 4, 2500g 離心10min, 取上清接種于Hep2 細胞, 2% FBS 1640 培養基, 37 , 5% CO2 培養, 逐日觀察細胞病變。同時取肺組織懸液上清空斑形成實驗分析肺組織病毒滴度。(5) 相關指標測定:1.空斑形成實驗測定病毒滴度:3105/ml Vero 細胞接種至6 孔板, 10%FBS 的1640 培養至單層致密無孔細胞, 接種10 倍倍比稀釋的病毒液100l, 每個濃度設復孔, 未感染病毒為對照孔。病毒吸附2h 后覆蓋含1.5%的瓊脂糖凝膠和2% FBS 的1640 培養基, 培養5 天, 5mg/ml MTT 顯色, 計數空斑, 計算病毒滴度: PFU/ml= 稀釋度 P= 該濃度下各孔空斑數; n= 復孔數; v= 每孔接種病毒液體積(ml)2.支氣管肺泡灌洗液白細胞計數:感染后第3 天、6 天和9 天處死小鼠, 氣管插管, 預冷生理鹽水0.5ml 灌洗2 次, 收集支氣管肺泡灌洗液( BALF) , 血球計數儀計數白細胞總數。4, 1000g 離心10min, 取細胞沉渣涂片,Wright 染色, 顯微鏡下計數200 個白細胞, 按中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞形態學特點分類計數。3. 直接免疫熒光實驗:取感染后第3 天小鼠BALF 離心細胞沉渣涂片, 4丙酮固定干燥, 按Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA 免疫熒光試劑盒說明書( Chemicon, USA) 鑒定RSV 抗原, 熒光顯微鏡下觀察結果。4. 肺組織病理學檢查:感染后第3 天、6 天處死小鼠, 取未經支氣管肺泡灌洗的右肺組織, 一部分4%多聚甲醛固定, 常規蘇木素- 伊紅( HE) 染色, 光鏡觀察形態結構。另一部分立即2.5%戊二醛固定, 送重慶醫科大學電鏡室包埋、制成超薄切片, 透射電鏡檢查。5. 免疫組織化學檢查:RSV 抗原免疫組織化學染色SP 染色試劑盒( 北京中杉生物技術公司) , 一抗是針對RSV 整個病毒抗原的山羊多克隆抗體( USBiological, USA) 。4%多聚甲醛固定肺組織, 常規切片, 各步操作按試劑盒說明進行, DAB 顯色后顯微鏡下觀察。同一標本未滴加一抗的切片作陰性對照。圖像分析采用北航真彩色病理圖像分析系統4.0, 平均光密度反映染色強弱。（三）可行性分析1.小鼠易獲得,易飼養;小鼠遺傳背景清楚而均一, 基因改造技術成熟, 已有多種商品化試劑,2.實驗器械容易解決;本實驗模型操作不復雜;3.實驗所需費用不多; 實驗時間不長。