實驗二 傳代細胞培養與病毒在傳代細胞中的培養一、實驗目的了解倒置顯微鏡的構造與使用，了解不同傳代細胞的形態及接毒后的病變特征，掌握細胞的傳代培養方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細胞的種類BHK-21：倉鼠腎傳代細胞PK-15：豬腎傳代細胞IBRS-2：豬腎傳代細胞Hela：人的子宮瘤細胞Vero：非洲綠猴腎細胞Marc-145：來源于Vero細胞TK-143：人的胸苷激酶陰性細胞Sf9：昆蟲細胞 三、材料1、100ml細胞瓶、吸管、吸球、96孔細胞培養板、加樣器、槍頭2、BHK-21（baby hamster kidney）細胞3、0.25%胰酶4、生長液：含10%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM 維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液（PRV）四、傳代細胞培養的條件要求1）細胞密度：2-3105個/ml2）pH范圍 最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培養溫度 哺乳動物細胞一般為37 昆蟲細胞28-30五、常用細胞分散劑與作用原理1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發生水解，導致細胞間質水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價鈣、鎂離子結合，從而使細胞分散。3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。六、營養液1、人工綜合營養液氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。2、血清1）血清的種類 胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56滅活30min。3）血清的作用A、能提供細胞生存、生長和增生所必須的生長調節因子。B、能補充基礎培養液中沒有或量不足的營養成分。C、含有一些可供貼壁依賴型細胞在培養器皿表面貼附和鋪展的生長基質成分。D、有中和毒性物質保護細胞不受傷害的作用。E、給培養液提供良好的緩沖系統。F、提供蛋白酶抑制劑，保護細胞免受細胞釋放的蛋白酶的損害。4）應用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細胞生長和繁殖的物質：補體、免疫球蛋白、生長抑制因子。B、血清的成分不明確，影響對結果的分析。C、不同動物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養結果不穩定。七、傳代細胞系培養1、優點：1) 可以無限的傳代。2) 不少細胞系對病毒很敏感。3) 某些傳代細胞系能在懸浮培養條件下培養，適合病毒抗原的大量生產。4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養條件不苛刻。2、缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。3、培養方法1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養液。2）加入2ml 胰酶消化液，于37培養箱放置幾分鐘，至細胞間出現空隙或細胞變圓后，倒去消化液。3）加入生長液,反復吹打幾次，使細胞分散成單個細胞，然后分裝于3個小瓶中。再在每個小瓶中補充生長液至10ml，然后置37培養箱培養，培養1-2天即可長成單層。八、病毒（PRV）在傳代細胞中的培養1、選長滿單層的細胞，倒掉培養液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養液，補足維持液，置溫箱中繼續培養，直至80%以上的細胞病變。5、收毒：將病變的細胞置于-20冰箱中，凍結后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。實驗三、原代細胞培養（以雞胚成纖維細胞為例）一、實驗目的 了解不同原代細胞的形態，掌握雞胚成纖維細胞的制備與培養方法。二、材料1、9-11日齡雞胚2、照蛋燈與蛋座3、碘酊棉球與酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小鑷子5、平皿、細菌瓶、吸管、吸球、細胞瓶、6、胰酶、生長液、維持液三、細胞培養的條件要求1）細胞密度原代細胞：4-6105個/ml傳代細胞：2-3105個/ml2）pH范圍 最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培養溫度哺乳動物細胞一般為37 昆蟲細胞28-30四、操作步驟1、取9-12日齡孵育良好的雞胚，依次用碘酊和酒精消毒氣室部。2、無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼，去除殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾住雞胚頸部，取出雞胚放于滅菌平皿中。3、用眼科剪、鑷去除雞胚頭、四肢及內臟，用DMEM沖冼2次。4、將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜狀。5、將剪碎的組織塊倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加DMEM。如此反復沖洗2-3遍。6、于沉淀組織塊內加入約4倍量的0.25%胰酶，并調pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次，使細胞消化完全（組織塊變散松，沉降漸變緩慢時即表示消化足夠）。7、取出，靜置幾分鐘，小心吸棄上層胰酶溶液，用DMEM輕洗2次后，加入生長液5ml，用大口徑吸管反復吹打，使細胞游離。8、靜置幾分鐘，使未消化好的組織塊下沉。9、細胞計數 取細胞懸液0.5ml+2ml 0.1%結晶紫枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37溫箱中5-10min，充分振蕩后進行計數。 按白細胞計數法計算4角4個大方格內的細胞總數（N）。 每ml懸液中的細胞數（n）=N/410000K（稀釋倍數）。 活細胞數應在90%以上。10、將計數好的細胞稀釋到合適的濃度，使細胞量約為4-6106個/ml，分層于細胞培養瓶中，每瓶1ml，再補加DMEM生長液至10ml，蓋上蓋子，置于37恒溫箱中培養。表示可計數表示不計數五、結果的觀察 于培養后每天觀察結果，至長層單層。細胞量較大時，一天即可長成單層，細胞呈纖維狀。實驗四 病毒感染力的滴定（TCID50的測定）一、實驗目的 了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數細胞培養物感染量TCID50的操作步驟、計算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數致死量LD50( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測半數雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測半數細胞培養物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用細胞來檢測蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細胞來檢測三、材料 1、長滿單層的細胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細胞培養板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續10倍的稀釋，從10-1-10-10。 2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100l。3、在每孔加入細胞懸液100l，使細胞量達到23105個/ml。 4、設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100l生長液+100l細胞懸液）5、逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天。6、結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TCID50的計算方法1、Reed-Muench兩氏法病毒液稀釋度出現CPE孔數無CPE孔數累 計出現CPE孔所占的%CPE孔數無CPE孔數10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6 （11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathic effect距離比例（高于50%病變率的百分數-50%）/（高于50%病變率的百分數-低于50%病變率的百分數） （91.6-50）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距離比例稀釋度對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數 =0.8(-1)+(-3) =-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.8接種100l可使50%的細胞發生病變。2、Karber法病毒液稀釋度出現CPE的孔數出現CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-60 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀釋度的對數D：稀釋度對數之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1(3.375-0.5) =-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.875接種100l可使50%的細胞發生病變。致細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）：指病毒在宿主細胞內大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現象。具體而言，體外組織細胞培養時，溶細胞病毒在易感細胞內大量復制增殖導致細胞死亡或細胞出現變圓、脫落、聚集等現象，稱為致細胞病變效應。在體外實驗中，通過細胞培養和接種殺細胞性病毒，經過一定時間后，可用顯微鏡觀察到細胞變圓，壞死，從瓶壁脫落等現象，稱之細胞病變作用。縮寫CPE。指病毒對組織培養細胞侵染后產生的細胞變性。利用此種病變效應可進行病毒定量。一般來說，腫瘤病毒的此種效應較弱，或是不具CPE。主要有以下幾種：1.整個細胞都發生改變，有兩種情況，其一是胞核及整個細胞都發生腫脹，胞漿呈顆粒樣變化，胞膜邊緣不整齊；其二是，整個細胞皺縮，變圓直至碎裂，脫落等，多見于腸道病毒、痘病毒、呼吸病毒、鼻病毒、科薩奇病毒；2.細胞發生聚合，如腺病毒；3.細胞融合形成合胞體，即多數細胞發生相互融合而成“巨細胞”，但各個細胞核仍然能分辨清楚，如副粘病毒、皰疹病毒；4.細胞僅產生輕微病變，如正粘病毒、狂犬病毒、冠狀病毒、逆轉錄病毒以及沙粒病毒。實驗五 血清中和試驗一、實驗目的 了解中和試驗的基本原理和幾種不同的測定方法，掌握固定病毒稀釋血清法的操作步驟和計算方法及含義。二、原理 抗體與相應的病毒粒子特異性地結合，使病毒的感染力喪失。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關系研究4、疫苗免疫原性的評價5、免疫血清的質量評價6、測定實驗動物血清中是否存在抗體四、分類(一) 蝕斑（痘斑）減數試驗將病毒正常血清混合物以及病毒待檢血清混合物分別接種到單層細胞上，隨后覆蓋營養瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒正常血清組和病毒待檢血清組產生的蝕斑數，兩者的差數表示待檢血清的中和能力。以試驗組的蝕斑數比對照組減少50%作為判定依據，血清稀釋度就是其蝕斑減數試驗效價。(二) 交叉保護試驗先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊，根據實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。這一方法的缺點是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。可用于以下幾方面：應用已知V鑒定未知V ；應用已知免疫血清鑒定未知V；應用已知V鑒定未知血清。（三）終點法中和試驗1、固定病毒稀釋血清法 將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般為100或200個TCID50、EID50或LD50）混合，置適當的條件下感作一定時間，再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或實驗動物，測定被檢血清阻止組織培養細胞、雞胚或實驗動物發生病毒感染的能力及其效價。以能保護50%組織培養細胞、雞胚或實驗動物不發生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數，作為該血清的50%中和效價（PD50）。2、固定血清稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清（對照組）和待檢血清同時進行測定，計算每一組的TCID50、EID50或LD50，然后計算中和指數。五、材料 1、長滿單層的細胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細胞培養板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）6、待檢血清、PRV陽性對照血清、PRV陰性對照血清六、操作步驟1、固定病毒稀釋血清法1）測定病毒液的TCID502）將測好TCID50的病毒液稀釋成200個TCID50的病毒懸液。3）在96孔微量培養板中將血清（預先56滅活30min）作連續倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50l生長液，再加50l待檢血清，混勻后，吸50l至下一孔，如此下去。一直到1256），每個稀釋度作4孔。4）在上述各孔內加入50l稀釋好的病毒液，混勻后放入37 5%CO2培養箱中作用45min-60min。5）同時設待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細胞對照，其中病毒對照要作 200個TCID50、20個TCID50、2個TCID50、0.2個TCID50 4個不同濃度的對照。6）感作完成后每孔加入100l細胞懸液，放37 5%CO2培養箱培養，逐日觀察并記錄結果，一般要觀察5-7天。 7）結果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。血清稀釋度CPE孔數無CPE孔數累計保護率%CPE孔數無CPE孔數12（10-0.3）04015100（15/15）14（10-0.6）04011100（11/11）18（10-0.9）131787.5（7/8）116（10-1.2）132466.7（4/6）132（10-1.5）315116.7（1/6）164（10-1.8）40900（0/9）1128（10-2.1）401300（0/13）1256（10-2.4）401700（0/17）距離比例=（高于50%的保護率-50% ）/（高于50%的保護率低于50%的保護率）=（66