植物生物技術第6章原生質體培養第一節原生質體研究的發展和應用第二節原生質體的分離與純化第三節原生質體培養及植株再生本章主要內容第6章原生質體培養名詞：原生質體了解原生質體培養的應用掌握原生質體分離的步驟掌握原生質體培養的方法本章教學目的與要求第6章原生質體培養

原生質體（Protoplast）含義：去掉細胞壁的由質膜包裹、具有生活力的裸露細胞。第6章原生質體培養微絲葉綠體線粒體質膜高爾基體細胞核內質網微管細胞壁液泡第一節原生質體研究的發展和應用第一節一、原生質體研究的發展1892年，Klercker用機械法分離植物原生質體1960年，Cocking用酶法制備高等植物原生質體首次獲得成功1971年，Takebe首次從離體煙草原生質體培養中獲得再生完整植株1986年，單個原生質體培養獲得成功二、原生質體的應用種質資源超低溫保存原生質體融合，克服生殖障礙篩選突變體遺傳轉化基礎研究：細胞壁的發生過程、膜的結構等的研究研究案例第一節第二節、原生質體分離、純化一、原生質體分離雙子葉外植體胚性細胞第2節、原生質體分離及純化多數植物分離原生質體的經典材料-----葉肉細胞。（一）外植體來源愈傷組織或懸浮細胞。第2節、原生質體分離及純化（二）分離方法機械分離法酶法分離法第2節、原生質體分離及純化1、機械分離法（Machanicalisolation）優點：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點：

（1）原生質體的產量低；

（2）方法繁瑣費力；

（3）局限性大第2節、原生質體分離及純化（1）酶的種類纖維素酶類：降解構成細胞壁的纖維素果膠酶類：降解連接細胞的中膠層，分開細胞半纖維素酶類蝸牛酶：花粉母細胞和四分體小孢子2、酶法分離（Enzymaticisolation）第2節、原生質體分離及純化（2）酶液的配制滲透壓穩定劑及pH酶的配比及濃度第2節、原生質體分離及純化（3）分離原生質體兩步分離法一步分離法方法有二：第2節、原生質體分離及純化圖示原生質體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶第2節、原生質體分離及純化葉片愈傷組織第2節、原生質體分離及純化二、原生質體純化第2節、原生質體分離及純化1、離心沉淀法原理：應用原生質體的比重大于溶液，離心后原生質體沉于底部。步驟：第一步原生質體溶液用400目網篩過濾。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸取上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀，如此2-3次。第四步用原生質體培養液洗1次，收集原生質體。第2節、原生質體分離及純化2、漂浮法原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網篩過濾。第二步：離心。第三步：取上清液，洗滌液重懸，離心。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質體，用培養液洗1次。第2節、原生質體分離及純化3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度。第2節、原生質體分離及純化三、原生質體活力測定1、形態識別：形態上完整，呈圓形，含有飽滿的細胞質，顏色鮮艷的即為存活的原生質體。2、染色識別1）0.1%酚番紅或Evans藍染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質體。第2節、原生質體分離及純化四、影響原生質體分離的因素從理論上講，只要用適當的酶處理，就能從任何活組織中分離得到原生質體但對于原生質體培養來說，要得到活性高、能進行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質體則受許多因素的影響原生質體分離時主要應考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。第2節、原生質體分離及純化1、基因型和外植體:

生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質體的關鍵，并影響著原生質體的復壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生用于原生質體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養物、原球莖、花瓣和葉表皮等第2節、原生質體分離及純化葉肉細胞是常用的材料,葉片很易獲得而且能充分供應。取材時，一般用剛展開的幼嫩葉片愈傷組織或懸浮細胞，避免植株生長環境的不良影響，可以常年供應，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便，無需消毒ABC第2節、原生質體分離及純化2、酶液及酶解方法用來分離植物原生質體的酶制劑纖維素酶、半纖維素酶：降解構成細胞壁的纖維素果膠酶：降解連結細胞的中膠層，使細胞從組織中分開，以及細胞與細胞分開酶解花粉母細胞和四分體小孢子時還要加入蝸牛酶離析酶（果膠酶）纖維素酶濃度在1%-3%，果膠酶在0.1%-1%，但也有例外第2節、原生質體分離及純化3.分離培養基常用的配制分離原生質體酶液的溶液以及洗滌原生質體的溶液為CPW液CPW鹽成分為第2節、原生質體分離及純化根據滲透劑的濃度和成分可分為以下幾種培養基:CPW13M:CPW鹽+13%甘露醇(mannitol)CPW9M:CPW鹽+9%甘露醇CPW21S:CPW鹽+21%sucroseCPW0M:CPW鹽溶液。多數情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴散入原生質體的速度很慢的緣故，來保證一個穩定的滲透壓第2節、原生質體分離及純化4、酶處理條件最主要的是酶處理時的溫度和pHpH大于6時不利于原生質體生存高溫下短時間分離的原生質體不適于培養，他們易發褐和破裂。一般常用溫度是23-28℃酶處理時間一般不超過24小時酶處理時在暗處培養葉片分離原生質體可在靜置條件下進行，懸浮細胞由于壁厚，培養（分離）過程中間斷低速震蕩有利于酶滲透第2節、原生質體分離及純化第三節原生質體培養及植株再生一、原生質體計數第6章原生質體培養原生質體培養前必須調到一定密度,即確定每毫升培養基中含多少原生質體用CPW9M懸浮原生質體,血球計數板計數,計算稀釋倍數離心,去除CPW9M,用所算體積的培養基懸起原生質體,用于培養計數室分成25個大方格（雙線隔開），每個大方格分成16個小方格，共400個小方格組成。計數室邊長為1mm，則計數室的面積為lmm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數室的高度為0.1mm，所以每個計數室的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。系數4X106二、培養方法第3節、原生質體培養1、液體淺層培養第3節、原生質體培養原生質體懸浮液1mm厚液體培養基2x105/ml特點：通氣好，原生質體代謝物易擴散，防止有害物質積累過多造成毒害，轉移添加新鮮培養基方便，便于觀察和照相。操作簡單，可微量培養。但原生質體沉淀，分布不均，細胞團聚集多，難成單細胞株系。2、平板培養原生質體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37

C左右）等體積混合成0.7%，培養于培養皿（2-3mm）中。第3節、原生質體培養特點：原生質體分布均勻，利于分裂，容易獲得單胞株系，可定位跟蹤觀察。原生質體釋放的有毒物質不易擴散。3、雙層培養法（固、液培養）

培養皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養基，在其上進行原生質體淺層培養。第3節、原生質體培養固體培養基特點：原生質體分布均勻，有利于分裂，易獲單細胞株系，能除去抑制分裂的有害物質，細胞植板率高。4、飼養層培養方法一：X-射線殺死原生質體，與生活力正常的原生質體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養于培養皿中。第3節、原生質體培養特點：以一種植物細胞制成的平板，支持另一種植物原生質體的生長。飼喂層沒有種的特異性。方法二：X-射線殺死原生質體，與0.7%瓊脂混合，在培養皿中鋪成平板，作為飼養層，再將生活力正常的原生質體與0.7%瓊脂混合，培養于飼養層上。4、飼養層培養特點：用材少，培養液消耗少，利于通風與觀察，可做原生質體不同密度的培養對比試驗，進行單細胞培養。第3節、原生質體培養三、原生質體培養基MS,KM8P,WPM第3節、原生質體培養四、原生質體培養及植株再生1、細胞壁再生

培養初期仍然為圓球形，隨著培養時間的延長，逐漸變為橢圓形，此時表明已經開始再生細胞壁不同植物原生質體培養再生細胞壁所需時間不一樣，從幾小時到幾天簡單的鑒別壁的再生的方法是用熒光增白劑專染纖維素,在熒光燈下發出熒光第3節、原生質體培養一些因素影響壁的再生①碳源②培養條件——固體培養時細胞壁再生比液體培養時快③滲透劑的種類第3節、原生質體培養第一次分裂第二次分裂第三次分裂多細胞團第3節、原生質體培養2.原生質體的分裂肉眼可見細胞團愈傷組織器官發生途徑胚胎發生途徑植株第3節、原生質體培養3.細胞團形成及植株再生五、影響原生質體培養及植株再生的因素1、原生質體來源分離原生質體所用外植體的生理狀態與原生質體的質量和其后的分裂頻率有著密切的關系在小麥原生質體培養中，3-6月齡的懸浮細胞系分離的原生質體分裂率比1月齡的原生質體高第3節、原生質體培養2.基因型同一植物不同基因型的原生質體脫分化與再分化所要求的條件不一樣，在相同條件下的再生能力也會不同第3節、原生質體培養3.培養基即使來源于同一種基因型的原生質體，在不同培養基中的再生能力也不一樣MS,KM8P，MS-KM等培養基培養基中的附加物質也會影響到原生質體培養效果，如激素、無機鹽組成、氨基酸、有機酸等。生長素過量使用易使液泡長大或增加新液泡，從而使細胞破裂第3節、原生質體培養4、滲透壓調節劑培養的原生質體隨發育進程需要不斷降低滲透壓，以促進細胞分裂。不同植物對調節劑的反應不一樣有些物種以蔗糖和果糖作碳源和滲透壓穩定劑時，細胞不能持續分裂，而用葡萄糖時，原生質體能持續分裂并形成細胞團蔗糖或葡萄糖單獨使用或與甘露醇結合作為穩定劑，一旦糖被降解，培養基滲透壓降低，很利于細胞分裂第3節、原生質體培養5.培養條件和方法密度:低于一定密度不能分裂,一般培養密度為:5×103—5×106/ml

固體培養要求密度較液體培養低光:暗培養利于壁形成和細胞再生。溫度:通常22-25℃第3節、原生質體培養6.微電流處理增強植物自身微電流作用降低氧化脅迫等第3節、原生質體培養六、原生質體再生植株的遺傳變異及利用1.染色體方