第2節基因工程的基本操作程序

第1課時目的基因的篩選與獲取和基因表達載體的構建

課標內容(1)闡明基因工程的原理和基本操作程序。

(2)嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。

一?自主梳理?

知識點1目的基因的篩選與獲取

1.培育轉基因抗蟲棉的四個步驟

(1)目的基因的篩選與獲取。

⑵基因表達載體的構建。

(3)將目的基因導入受體細胞。

(4)目的基因的檢測與鑒定。

2.篩選合適的目的基因

廠屯門在基因工程的設計和操作中，用于改變

設一受體細胞性狀或獲得預期表達產物等

［囚J的基因，主要是指編碼蛋白質的基因

篩選目從相關的已知結構和功能清晰的基因

的基因「中進行篩選是較為有效的方法之一

3.獲取目的基因的方法

人工合成目的基因

常用小旦特異性地快速擴增目的基因

'通過構建基因文庫來獲取目的基因

4.利用PCR獲取和擴增目的基因

(l)PCR的含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫,它是一項根據DNA半保留復制

的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核背

酸序列進行大量復制的技術。

(2)基本條件

DNA母鏈

便移14種脫氧核甘酸

途〉耐高溫的DNA聚合酶

閨%V使DNA聚合酶能夠從引物的￡端開始

也多片連接脫氧核昔酸

(3)過程

基于PCR的過程，完成下列問題:

,5'...............................

IIIIIIIIIIIIIIII

待擴增的DNA片段

飛....“

冊

過程I為變性,該階段的溫度為卻，以上，目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈。

過程n為復性,該階段的溫度為為左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條

單鏈DNA結合。

過程HI為延伸,該階段的溫度為72—g左右，該過程需要在耐高溫的DNA聚合

鱉的催化下，利用4種脫氧核甘酸為原料,根據堿基互補配對原則從子鏈的支端

延伸合成新的子鏈DNA。

(4)儀器：PCR擴增儀(RCR儀)。

(5)PCR產物的鑒定方法：瓊脂糖凝膠電泳。

知識點2基因表達載體的構建

1.構建基因表達載體的目的

⑴使目的基因在受體細胞中穩定存在,并且遺傳給下一代。

(2)使目的基因能夠表達和發揮作用。

2.基因表達載體的組成

位置：目的基因的上游

功能.(RNA聚合酶識別和結合的部位

JI驅動基因的轉錄

廣-------------------------------

啟為子/目的基因：人們所需要的基因

終

止;位置：目的基因的下游

表達載體子

復以】功能：終止轉錄

原點

標記基因:便于重組DNA分

子的篩選

3.基因表達載體的構建過程

(1)首先用一定的限制酶切割載體。

(2)然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

(3)再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。

夕卜1原DNA

限制晦

兩個切口，獲

一個切口，、DNA連接酶

取目的基因

兩個黏性末端

基因表達載體

度自查自糾,

⑴從已知結構和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方

法。(V)

(2)Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。

(X)

提示：酶是耐高溫的DNA聚合酶。

(3)基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位。(X)

提示：啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。

(4)PCR擴增技術中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚。(X)

提示：不需要解旋酶。

(5)DNA聚合酶能夠從引物的5,端開始連接脫氧核甘酸。(X)

提示：3'端。

-?合作探究?

一、利用PCR獲取和擴增目的基因

【情境探疑】

圖1、圖2分別是PCR擴增技術相關過程，請思考回答下列問題:

|變性

|復性

第一輪循環

弓I物B

innnnnf引物A

111$

*11111111111111111111111111111111111111111111111,-

|變性

圖1

第1組(引物I?1"I-I-I~I~I

引物［引物n■CAGGAT

~1-I-I-I-I-I

ATCCTG

第2組(引物i'?n~?~?~?~??~?~?~?~r

引物［引物n：AACTGCAGTT

"i~i-i_i_ii-i-i_i~r

CGACTGATTA

圖2

⑴請完善圖1中的信息。

(2)高溫變性的目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈。

(3)PCR所需引物是依據目的基因的一段已知序列設計而成的,圖1中引物A與

引物B不同(填“相同”或“不同”)，其在PCR過程中丕能(填“能”或“不能”)

重復利用。

(4)DNA復制時為什么需要引物？

提示：在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3,

端延伸DNA鏈，因此DNA復制時應加入兩種引物。

(5)圖1所示利用PCR技術擴增目的基因，從第幾輪循環才會產生完整的目的基

因(可用相關圖解解釋)？

提示：第3輪，如圖所示：

——完整的

—目的基因

——完整的

一目的基因

第1輪第2輪第3輪

(6)圖2是某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理，請分別說明

理由。

提示：第1組：引物I和引物n局部發生堿基互補配對而失效。第2組：引物I，

自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效。

(7)要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進行什么操作？

提示：要在兩種引物的5,端分別添加上限制酶的識別序列。

(8)如果循環〃次，則共需消耗多少對引物？

提示：共需消耗(2〃一1)對引物。

國歸納提升

L引物

DNA復制時，DNA聚合酶不能從DNA模板鏈的一端直接開始合成子鏈，而是需

要從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸，形成DNA子鏈。因此進行PCR擴增的前

提是栗有一段已知目的基因的核甘酸序列來合成引物。

(1)引物的本質：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈

核酸，既可以是DNA單鏈，也可以是RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，

也需栗引物，一般是RNA片段。

(2)引物的長度：用于PCR的引物長度通常為20?30個核苜酸。

⑶一個PCR反應所需引物的種類：2種。DNA的兩條鏈是反向平行的，2種弓I物

要分別與兩條模板鏈結合。

2.PCR所需栗的原料

在PCR過程中實際加入的為dNTP,即脫氧核糖核甘三磷酸，包括dATP、dGTP、

dTTP、dCTPo其分子結構為：

中~中~魯r2^^3（A、G、C、T）

脫氧核糖

既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

3.生物體內DNA復制與PCR技術的比較

，PCR技術.‘DNA復制：

慳必昱作用下厥解旋酶催;

變性解砒.［方式J

細胞外（在PCR擴增r—.內（主要在細胞

儀內）?但曳?核內）

“吉PMnNTA取入DNA解旋酶、普通的

耐圖溫的DNA聚合.|酶1DNA喂公酶等

酶（TagDNA聚合酶）DNA兼口悔寺

分別從兩條鏈的引rXn晶般金上二N

物的3,端開始延伸，，制臀；

都是連續合成華鏈不連續合成，再由

取DNA連接酶連接

3cm--------------5'I八3'

5，「山?；亙；,父：

變性一復性一延伸,邊解旋，邊上制

兩個引物之間的旦完整DNA

DNA片段'-----1

1

需控制溫度，在較叵國別哈*一。心攵在

高溫度下進行.條件,細胞內溫和條件

【典例應用】

例1下列有關體內DNA復制與PCR技術比較的敘述，錯誤的是（）

A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5,端一3,端

B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現解旋

C.體內DNA復制需要能量，PCR反應也需要能量

D.二者遵循的堿基互補配對原則相同

答案B

解析DNA體內復制與利用PCR技術擴增DNA時，子鏈的延伸方向相同，均為

5,端一3,端，A正確；PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，在高溫條件下氫

鍵斷裂，B錯誤；DNA體內復制與利用PCR擴增DNA時都需要能量，但兩者所

需能量來源不同，C正確；DNA體內復制與利用PCR擴增DNA時，遵循的堿基

互補配對原則相同，D正確。

例2(2023?山東濟寧高二檢測)通過咽拭子取樣進行RT-PCR技術檢測是臨床上

診斷新冠病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸檢測的RT-PCR試劑盒的部

分工作原理簡圖如圖所示：

含病毒樣本裂解病毒RNART-PCR

(痰、鼻咽拭子)怎審*

(l)RT-PCR是指以病毒的RNA為模板通過_______過程合成cDNA,并對cDNA

進行PCR擴增的過程。利用RT—PCR試劑盒對新冠病毒進行檢測時，除借助上

述RT-PCR技術外，還需要有特異性探針，利用該探針對新冠病毒進行核酸檢

測方法是。若用RT-PCR技術擴增胰島素基因，應選擇

細胞提取RNAo

(2)PCR與體內DNA復制相比，不需要酶。利用PCR技術擴增目的基因

的前提是.0

(3)若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入個引物。

(4)PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、_______三步，其中復性的結果是

__________________________________________________________________________O

答案(1)逆轉錄PCR等技術胰島B(2)解旋有一段已知目的基因的核昔

酸序列作為模板，以便合成引物(3RU—2(4)延伸兩種引物通過堿基互補配

對與兩條單鏈DNA結合

解析(1)以RNA為模板合成cDNA的過程為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶

的參與；探針是指被放射性同位素標記或熒光標記的一段單鏈核酸，因此制作該

探針的依據是新冠病毒的核甘酸序列，利用該探針對新冠病毒進行檢測的方法是

PCR等技術。PT—PCR技術首先是以RNA為模板合成cDNA,因此應選擇胰島

B細胞提取RNAo

(2)PCR技術是利用DNA在高溫條件下解開雙鏈，因此與體內DNA復制相比，

不需要解旋酶。利用PCR技術擴增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核昔

酸序列作為模板，以便根據這一序列合成引物。

(3)PCR技術大量擴增目的基因時，緩沖液中需要加入的引物個數即為新增單鏈數

=22n—2,因此，若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入

2.210—2=2"—2個引物。(4)PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三

步，其中復性的結果是兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。

境題后反思

用PCR可以擴增mRNA嗎？

提示：mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。由mRNA

逆轉錄形成cDNA的過程是：①逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的

DNA鏈，形成RNA—DNA雜交分子。②用一定的方法降解RNA—DNA雜交分

子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA,即cDNA。

二、基因表達載體的構建

【情境探疑】

目的基因導入受體細胞之前，需構建基因表達載體，圖甲、乙表示質粒及目的基

因所在DNA片段，圖中箭頭表示相關限制酶的切割位點。

EcoRI目的基因EcoRI

llllllllllllllllllMlllllllllllllllllllll夕卜源DNA

1I

Ba777HISmaIHindHI

乙

(1)構建基因表達載體時需要使用的工具酶為限制酶和DNA連接酶。

(2)用圖中質粒和DNA構建基因表達載體時，不能使用SmaI切害U，原因是SmaI

會破壞質粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。

(3)構建基因表達載體時，可用EcoRI同時切割質粒和DNA,但會導致目的基因

和質粒的自身環化、目的基因不能定向連接等問題,為避免以上問題出現，應使

用BamHI和印“dill(或EcoRI和HindHI)兩種限制酶。

(4)構建好的基因表達載體在目的基因前要加上啟動壬，其是RNA聚合酶識別和

結合的部位。

厘歸納提升

限制酶的選擇技巧

PstISmaIPst1

LI_i

I抗病基因I

SmaIEcoRI

甲乙

⑴根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類

①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PS/IO

②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaIo

③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目

的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶（但要確保質粒上

也有這兩種酶的切割位點）。

（2）根據質粒的特點確定限制酶的種類

;其切割位點11其會破壞啟動：

，不在啟動子,XhoI；子，不宜選擇，

［與終止子之:'一

其

位于

洞，不宜選擇，HindJR

動

啟

子

后動子NdeI'止

終

子

抗生素XbaI間

之

擇

Pst1抗性基因終止附BamHl選

宜

一

子一

山友位于加6EcoRI」

記基因中，：一

［其會破壞終止：

不宜選擇；

:子，不宜選擇，

;復制原點被破壞后，目的基因不；

〔能在受體細胞中復制，不宜選擇）

（3）根據Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶，下圖中甲、乙、丁的Ti質粒均不宜選

取，而丙的Ti質粒宜選取（設切割目的基因的限制酶為XbaI和SacI）。

T-DNAT-DNA

切割位點不位于T-DNA上

XbaISacIXbaIXbaI

丙\

切割位點位于T二DNA上，切割位點雖

而且含XbaI、SacI兩種在T—DNA上，

切割位點，恰與目的基因但缺乏SacI

兩端的切割位點相同的切割位點

【典例應用】

例3（多選）某實驗小組利用下圖所示的質粒和目的基因來構建基因表達載體，將

目的基因導入大腸桿菌細胞并表達。下列敘述正確的是（）

氨節青霉素抗性基因

酶A酶A酶C

I_

酶

pBR322Bt）

酶A

酶B目的基因

7酶C

啟動子四環素

抗性基因

A.圖中的質粒用酶A切割后，會產生4個游離的磷酸基團

B.在構建重組質粒時，可用酶A和酶C切割質粒和目的基因

C.成功導入目的基因的大腸桿菌可在含四環素的培養基中生長

D.若用酶B和酶C切割，可以避免質粒的自身環化

答案AD

解析限制酶每一次切割后會得到兩個黏性末端，會有2個游離的磷酸基團，而

圖中的質粒含有2個酶A的切割位點，則會產生4個游離的磷酸基團，A正確；

在構建重組質粒時，可用酶B和酶C切割質粒和目的基因，假如用酶A切割質

粒會破壞兩個標記基因，B錯誤；用酶B和酶C切割質粒時四環素抗性基因被破

壞，成功導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芾青霉素的培養基中生長，C錯誤；

用酶B和酶C兩種限制酶切割可以避免目的基因和質粒自身環化和兩者之間的反

向連接等問題，D正確。

例4（2023?天津濱海新區期末）下列關于基因表達載體構建的敘述，錯誤的是

（）

A.啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點，組成它的基本單位是脫氧核昔酸

B.基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標記基因等組件

C.人工構建的誘導型啟動子，當誘導物存在時，可激活或抑制目的基因的表達

D.由于受體細胞不同，基因表達載體的構建也有所差別

答案B

解析啟動子在基因的首段，它是RNA聚合酶識別和結合的位點，組成它的基

本單位是脫氧核甘酸，A正確；基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終

止子、標記基因等組件，B錯誤；人工構建的誘導型啟動子，當誘導物存在時，

可激活或抑制目的基因的表達，C正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物

之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建是不完

全相同的，D正確。

例5（2023?天津濱海新區高二期末）基因工程中，需使用特定的限制性內切核酸酶

切割目的基因和質粒，便于重組和篩選。已知限制性內切核酸酶I的識別序列和

切割位點是一G^GATCC—,限制性內切核酸酶H的識別序列和切割位點是

—*GATC—,根據圖示分析下列敘述正確的是（）

GGATCC目的基因GATC

liwiii血iwiiliHi-

CCTAGGCTAG

注：GeneI和GeneH表示兩種標記基因

。表示限制酶僅有的識別序列放大

A.質粒用限制性內切核酸酶n切割，目的基因用限制性內切核酸酶I切割

B.用限制性內切核酸酶切割獲得目的基因時，有四個磷酸二酯鍵被水解

c.限制性內切核酸酶I和限制性內切核酸酶n切割后獲得的黏性末端不同

D.質粒中標記基因的作用是便于篩選出目的基因已經表達的細胞

答案B

解析限制性內切核酸酶n能識別限制性內切核酸酶I的識別序列，限制性內切

核酸酶I不能識別限制性內切核酸酶n的識別序列；要將目的基因從該DNA鏈

中提取出來，需要在目的基因左右切開，所以要用限制性內切核酸酶n；質粒不

能用限制性內切核酸酶n,若用該酶切割，質粒的兩個標記基因均被破壞，A錯

誤；由于DNA是雙鏈，用限制性內切核酸酶n將目的基因左右切開時，有四個

磷酸二酯鍵被水解，B正確；限制性內切核酸酶I和限制性內切核酸酶n切割產

生的黏性末端相同，c錯誤；質粒中標記基因的作用是用來篩選含有目的基因的

受體細胞的，D錯誤。

課堂小結?-

思維導圖晨讀必背

LPCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，該技

術的原理是DNA半保留復制。

2.PCR反應進行的條件有緩沖溶液、

人工合成目的基因

DNA模板、2種引物、4種脫氧核昔酸、

目的基因的:通過構建基因文庫獲取目的基因

篩選與獲取

,利用小區獲取和擴增目的基因耐高溫的DNA聚合酶、溫度條件等。

3.PCR擴增的過程：變性一復性一延伸。

而菽」啟動子、目的基因、終

（闞匹L止子、標記基因等

基因表達載4.在構建基因表達載體時，首先會用一

體的構建\杓建］限制酶切割、DNA連

1-----接酶連接定的限制酶切割載體，然后再用同種限

制酶或能產生相同末端的限制酶切割含

有目的基因的DNA片段；再利用DNA

連接酶連接形成重組DNA分子。

隨堂檢測

1.下列關于PCR反應體系中所加物質作用的敘述，錯誤的是（）

A.耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成

B.引物使TaqDNA聚合酶能從引物的5,端延伸DNA鏈

C.目標DNA的雙鏈用作合成DNA復制的模板

D.四種脫氧核甘酸為PCR提供原料

答案B

解析通過PCR技術擴增目的基因時，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個脫

氧核甘酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復制時，引物與DNA母鏈通過堿基互

補配對結合后，ThqDNA聚合酶從引物的3,端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成

方向總是從子鏈的5,端向3,端延伸，B錯誤；PCR技術的原理是DNA半保留復

制，DNA復制時兩條鏈均作為復制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫

氧核甘酸，D正確。

2.如圖是基因工程中基因表達載體的模式圖，若結構X是表達載體所必需的，則

X最可能是（）

x目的基因

終止子

抗生素抗

性基因

復制原點

A.目的基因插入位點B.啟動子

C.標記基因D.DNA聚合酶識別位點

答案B

解析基因表達載體由啟動子、終止子、標記基因、復制原點和目的基因等組成。

題圖中有終止子、標記基因（抗生素抗性基因）、目的基因、復制原點等，還缺少

啟動子。啟動子位于基因的上游，所以X最可能是啟動子，B正確。

3.在核酸分子雜交技術中，常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針（探針是指

以放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記的已知核昔酸序列的核酸片段）。

為了獲得B鏈作探針，可應用PCR技術進行擴增，應選擇的引物種類是（）

A鏈

引物1引物2

引，物33,引物4

B鏈

A.引物1與引物2B.引物3與引物4

C.引物2與引物3D.引物1與引物4

答案C

解析要獲得B鏈，根據PCR中子鏈延伸方向為夕到3、則需選擇引物2與引物

3進行擴增，故選C。

4.（2023?海南中學高三一模）PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，下圖表示PCR的過程,

下列敘述錯誤的是（）

引物a

1

90t50t72

AB|C

引向兩個分子

DNA樣品bDNA

A.反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶在B過程起作用

B.引物a和引物b的長度應適宜，且相互之間不能發生堿基互補配對

C.PCR是體外進行的DNA擴增，PCR擴增遵循DNA半保留復制原則

D.A過程通過高溫破壞DNA分子中的氫鍵，使雙鏈DNA解聚為單鏈

答案A

解析反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶的作用是催化合成DNA子

鏈，在C過程中起作用，A錯誤；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列

互補配對的短單鏈核酸，用于PCR的引物長度通常為20?30個核甘酸，且引物

之間不能發生堿基互補配對，否則引物之間會配對形成雙鏈核酸從而失去作用，

B正確；PCR是體外進行DNA擴增的技術，根據題圖可知，PCR擴增遵循DNA

半保留復制原則，C正確；A過程為DNA變性過程，該過程通過高溫破壞DNA

分子中的氫鍵，當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，D正確。

5.（多選）（2023?遼寧六校聯考）DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因（如圖甲）

插入適宜的質粒（如圖乙）中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞

內表達的產物可直接誘導機體產生免疫應答。可選擇的限制酶分別是Bglll.

EcoRI和Sau3AI0下列分析正確的是（）

A.構建DNA疫苗時，可用3g/n和Sau3AI切割目的基因和質粒

B.若用EcoRI切割質粒，產生的DNA片段具有黏性末端

C.用EcoRI切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接，會產生多種連接產物

D.圖乙質粒用EcoRI切割前后，分別含有2個和4個游離的磷酸基團

答案ABC

解析分析題圖，外源DNA分子和質粒上都含有3種限制酶（3g/n、EcoRI和

SOM3AI）的切割位點，為了防止目的基因和質粒自身環化和兩者之間的反向連接,

構建DNA疫苗時，可用Bg/n和SQM3Al切割目的基因和質粒，A正確；EcoRI

切割后獲得的是黏性末端，B正確；用EcoRI切割目的基因和質粒，再用DNA

連接酶連接，能產生多種連接產物，如目的基因自身環化、質粒自身環化、目的

基因與質粒正向連接、目的基因與質粒反向連接等，C正確；圖乙質粒用EcoRi

切割前為環狀DNA分子，不含游離的磷酸基團，切割后為鏈狀DNA分子，含有

2個游離的磷酸基團，D錯誤。

課時精練

（時間：30分鐘）

【基礎對點】

知識點1目的基因的篩選與獲取

1.實驗室常用PCR技術對DNA進行體外擴增，下列相關敘述錯誤的是（）

A.PCR反應中目的基因呈指數形式擴增

B.反應過程包括變性一復性一延伸

C.90℃以上時雙鏈DNA的氫鍵斷開

D.引物與模板結合后向引物的5,端方向延伸DNA鏈

答案D

解析引物與模板結合后向引物的3,端方向延伸DNA鏈，D錯誤。

2.（2023?北京市十一中學期中）用PCR擴增下面的DNA片段：

5'GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG3'

3'CTGGACACCTTCG.......GTATGCCCTAAC5,

供選擇的引物有：

①5'GACCTGTGGAAGC3'

②5ATACGGGATTG3'

（3）5,GTATGCCCTAAC3,

@5,CAATCCCGTATG3,

共四種，應選擇（）

A.①②B.②③

C.③④D.①④

答案D

解析用PCR擴增DNA片段的過程中，在引物作用下，耐高溫的DNA聚合酶

從引物3,端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5,端至3,端延伸的，

故引物的堿基序列應與每條模板鏈5,端的一段核甘酸鏈的堿基序列相同，即應以

模板鏈5,端的一段脫氧核甘酸單鏈片段作為引物；由題干信息分析可知，5,端的

堿基序列是5"GACCTGTGGAAGC和59AATCCCGTATG,故對應的引物為

①5'GACCTGTGGAAGC3'和④5'CAATCCCGTATG3',D正確，A、B、C錯誤。

3.下列關于PCR的敘述，正確的是（）

A.PCR是體外復制DNA技術，關鍵酶是解旋酶和DNA聚合酶

B.DNA聚合酶從引物的5,端開始連接脫氧核昔酸

C.第三輪循環產物中出現位于兩種引物之間的DNA片段

D.延伸過程需要酶、ATP和4種核糖核甘酸

答案C

解析PCR體外復制DNA不需要解旋酶，需要耐高溫的DNA聚合酶，A錯誤；

DNA聚合酶從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸，B錯誤；第三輪循環產物中出現

位于兩種引物之間的DNA片段，C正確；PCR是在較高溫度條件下進行的，該

過程需要耐高溫的DNA聚合酶，且PCR反應的產物是DNA,因此原料是4種游

離的脫氧核甘酸，不是核糖核甘酸，D錯誤。

4.下列有關獲取目的基因的敘述錯誤的是（）

A.目的基因就是編碼蛋白質的基因

B.篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步

C.來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因

D.序列比對工具的應用為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會

答案A

解析目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，A錯誤；目的基因的篩選與獲取是

實施基因工程的第一步，B正確；來自蘇云金桿菌的及基因可作為培育轉基因抗

蟲棉用到的目的基因，C正確；隨著測序技術的發展，以及序列數據庫和序列比

對工具等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，這為科學家找到合

適的目的基因提供了更多的機會和可能，D正確。

5.（2021.湖北卷，16）某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基

因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。

為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度

答案D

解析PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA

的量不會減少反應中非特異條帶的產生，A錯誤；延長熱變性的時間，有利于雙

鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應中非特異條帶的產生，B錯誤；延長延伸的

時間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應中非特異條帶的產生，C錯誤；

在一定溫度范圍內，選擇較高的復性溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，

D正確。

知識點2基因表達載體的構建

6.（2023?黑龍江齊齊哈爾期中）基因工程的核心是構建基因表達載體，下列不屬于

載體作用的是（）

A.載體能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”

B.載體能協助目的基因在受體細胞中復制

C.載體含有啟動子和終止子協助目的基因表達

D.載體具有標記基因，便于篩選含目的基因的受體細胞

答案A

解析載體不能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”，A錯誤；載體在受體細

胞中能夠穩定存在，并且自我復制，使目的基因數量擴大，B正確；啟動子是RNA

聚合酶的識別和結合的位點，能啟動轉錄過程，終止子控制著轉錄的結束，所以

載體含有的啟動子和終止子可協助目的基因的表達,C正確；載體具有標記基因，

標記基因便于篩選含有目的基因的受體細胞，D正確。

7.（2022.廣西柳州一中月考）下列關于基因表達載體的說法，錯誤的是（）

A.基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟

B.基因表達載體包含啟動子、目的基因、終止子、標記基因等

C.終止子位于目的基因的下游，能夠終止翻譯過程

D.不同的目的基因所需的啟動子不一定相同

答案C

解析基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，其中啟動子

位于目的基因的上游，是啟動轉錄的一段DNA片段，終止子位于目的基因的下

游，能夠終止轉錄過程，B正確，C錯誤；不同的目的基因具有不同的核甘酸序

列，其啟動子也不盡相同，D正確。

8.（2023?黑龍江哈爾濱期末）蜘蛛絲是天然蛋白纖維，其機械性能高于常用于制作

防彈衣的凱夫拉纖維，有廣泛的應用前景。近期，中國科學家利用質粒（如圖）成

功構建了蛛絲蛋白基因的重組質粒，并在家蠶絲腺細胞中獲得大量蛛絲蛋白。下

列有關說法錯誤的是（）

XbaISacI

終止子

啟動子/X\

力箭頭所指的位

標記基因i入〃置是限制酶識

HindHI別和切割位點

A.為防止目的基因自身環化，可以用限制酶XOaI和SacI來切割目的基因

B.構建表達載體時選用蠶絲蛋白基因的啟動子利于基因在家蠶絲腺細胞中表達

C.啟動子是RNA聚合酶的識別和結合部位，可以驅動遺傳信息的復制和轉錄

D.基因表達載體中的標記基因可以鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細胞

答案C

解析用限制酶Xbal和SacI來切割目的基因，可以使目的基因兩端產生不同

的黏性末端，防止目的基因自身環化，A正確；為能從蠶絲腺細胞中提取蛛絲蛋

白，基因表達載體中目的基因的上游必須含有使其能在蠶絲腺細胞中轉錄的啟動

子，即構建表達載體時選用蠶絲蛋白基因的啟動子利于基因在家蠶絲腺細胞中表

達，B正確；啟動子只能驅動基因轉錄，不能驅動其復制，C錯誤；基因表達載

體中的標記基因的作用是鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細胞，D正確。

9.（2023?南師附中期初）載體是基因工程中攜帶外源DNA片段（目的基因）進入受體

細胞的重要運載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達載體。下

圖是利用細菌生產人胰島素的基本流程示意圖，下列相關敘述錯誤的是（）

A.重組載體A、重組載體B分別是基因克隆載體和基因表達載體

B.載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點、復制原點和標記基因

C.必須把目的基因插入重組載體A的啟動子和終止子之間

D.培養細菌A和細菌B的培養基在營養成分和功能上有明顯差異

答案C

解析重組載體A導入受體菌后隨著受體菌的繁殖而擴增，因此是基因克隆載體,

而重組載體B導入受體菌后，表達產生胰島素，因此是基因表達載體，A正確；

作為運載體必須要具備的條件有：含有限制酶的切割位點（便于目的基因的插入）、

復制原點（便于目的基因的擴增）及標記基因（便于篩選含有目的基因的受體細胞）

等，因此載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點、復制原點和標記基因，B

正確；培養細菌A的目的是擴增目的基因，不需要獲得表達產物，因此目的基因

不一定要插入重組載體A的啟動子和終止子之間，C錯誤；培養細菌A的目的是

擴增目的基因，培養細菌B的目的是獲得胰島素，因此培養兩者的培養基在營養

成分和功能上有明顯差異，D正確。

【綜合提升】

10.（2023?河南商丘聯考）PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合

成技術。下列有關PCR技術的敘述正確的是（）

A.打開DNA雙鏈需依賴解旋酶

B.子鏈延伸的方向是3,端一5,端

C.所用的引物一定是單鏈DNA分子

D.PCR反應需要在一定的緩沖溶液中進行

答案D

解析在PCR技術中，DNA的解旋是通過控制溫度實現的，超過90℃,雙鏈

DNA解聚，A錯誤；DNA聚合酶從引物的3,端開始延伸DNA鏈，因此，DNA

的合成方向是從子鏈的夕端向3,端延伸，B錯誤；引物可以是單鏈DNA分子，

也可以是單鏈RNA分子，C錯誤；PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，

PCR反應的緩沖溶液的作用是給PCR體系提供一個最適反應條件，D正確。

11.（多選）下列有關PCR與體內DNA復制的敘述，正確的是（）

A.都屬于半保留復制

B.都需要DNA聚合酶和DNA連接酶

C.所需的酶在相同溫度下活性不同

D.PCR需要一小段人工合成的DNA或RNA做引物

答案ACD

解析PCR過程中兩條鏈是單獨、連續合成的，不像體內DNA復制時，兩條子

鏈在同一復制叉中合成，一條鏈不連續，所以PCR過程不需要DNA連接酶，B

錯誤。

12.（2023?北京朝陽區模擬）PCR弓I物的3,端為結合模板DNA的關鍵堿基，5,端無

嚴格限制，可用于添加限制酶酶切位點等。下列敘述正確的是（）

A.該圖表示PCR循環中的變性環節

B.dNTP作為擴增的原料會依次連接到5,端

C.耐高溫的DNA聚合酶催化相鄰的兩個dNTP之間形成磷酸二酯鍵

D.用圖中引物擴增兩個循環后即可獲得兩端添加限制酶酶切位點的產物

答案C

解析圖中引物與模板鏈堿基互補配對，該圖表示PCR循環中的復性環節，A錯

誤；DNA聚合酶只能催化脫氧核甘酸連接在3,端，所以dNTP作為擴增的原料會

依次連接到3,端，B錯誤；延伸時，在耐高溫的DNA聚合酶催化下，相鄰的dNTP

間形成磷酸二酯鍵，C正確；由于兩個引物均不在該片段的端點，因此第一輪循

環后得到的兩個DNA片段中兩條脫氧核甘酸鏈都不等長，第二輪中亦不會出現

兩條鏈等長的目的DNA片段，在第三輪循環產物中