3.2基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序2.基因工程每一步涉及的技術和方法獲得目的基因后直接轉入受體嗎？

不是，游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因。2.基因表達載體的構建構建基因表達載體的目的使目的基因在受體細胞中穩定存在使目的基因可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達和發揮作用基因表達載體的構建是基因工程的核心工作。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識別和結合位點，啟動轉錄過程。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉錄。篩選含目的基因(重組DNA分子)的受體細胞2.基因表達載體的構建2.基因表達載體的構建“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動子與終止子位于DNA分子中，起始和終止轉錄過程。啟動密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，起始和終止翻譯過程。(1)基因工程中的基因表達載體≠載體：基因表達載體與載體相比增加了

。

目的基因(2)目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位注意:基因表達載體構建的流程：①用限制酶切割載體，使它出現一個缺口；②用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，獲取目的基因；③用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體缺口處，形成重組DNA分子（基因表達載體、重組質粒）。重組DNA分子目的基因2.基因表達載體的構建

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。1.下列哪項不是基因表達載體的組成部分()A．啟動子 B．終止密碼子C．標記基因 D．目的基因B2、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是()A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用C．標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A2.基因表達載體的構建常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。轉化：目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達方法：植物細胞：動物細胞：微生物細胞：花粉管通道法、農桿菌轉化法、基因槍法顯微注射技術Ca2+處理法(感受態細胞法)由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構建也會有差別；3.將目的基因導入受體細胞花粉外源DNA花粉管子房胚珠1.花粉管通道法：②在植物授粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物細胞：3.將目的基因導入受體細胞植物花粉在柱頭上萌發后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。我國科學家獨創的一種方法吸引農桿菌向受傷組織集中雙子葉、裸子植物傷口分泌酚類物質和糖類物質受損將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞中，并且將其整合到該細胞染色體DNA上。農桿菌轉化法激活Vir區基因，導致T-DNA加工和轉移植物細胞：3.將目的基因導入受體細胞特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力表達載體提純受精卵胚胎雌性動物的輸卵管或子宮內顯微注射早期胚胎培養胚胎移植新性狀的動物發育顯微注射法動物細胞：3.將目的基因導入受體細胞受精卵全能性高，高度分化的體細胞全能性受到抑制Ca2+

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入宿主細胞。感受態細胞吸收大腸桿菌感受態細胞Ca2+混合表達載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉化Ca2+處理法微生物細胞：3.將目的基因導入受體細胞使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態外源基因在受體細胞中能表達的原因(基因工程得以實現的理論基礎)：②基因是控制生物性狀的基本遺傳單位，其表達具有一定的獨立性，不同生物的基因在表達時都遵循“中心法則”，在受體細胞內定向表達；(前提條件)①不同生物的DNA分子的結構基本相同，都以4種脫氧核苷酸為基本組成單位，具有獨特的雙螺旋結構(物質基礎)；③所有生物共同一套遺傳密碼。(表達提供可能)Ca2+Ca2+處理法微生物細胞：3.將目的基因導入受體細胞受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術感受態細胞法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上↓轉入農桿菌中↓導入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上提純含目的基因的表達載體↓顯微注射↓受精卵發育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細胞↓感受態細胞↓基因表達載體與感受態細胞混合↓感受態細胞吸收DNA分子3.將目的基因導入受體細胞1、基因工程常用的受體細胞有①大腸桿菌②枯草桿菌

③支原體

④動植物細胞A．①②③④B．①②③

C．②③④

D．①②④D2、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達C3.將目的基因導入受體細胞3.體細胞不同，將目的基因導入受體細胞的方法也不相同，下列受體細胞與導入方法匹配錯誤的是()選項受體細胞導入方法A棉花細胞花粉管通道法B大腸桿菌農桿菌轉化法C羊受精卵顯微注射技術D小麥細胞基因槍法B3.將目的基因導入受體細胞

在棉花細胞中，重組表達載體是否導入成功？是否可以穩定維持并表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？4.目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。1.目的：2.檢測內容及方法：類型檢測內容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉錄出了mRNAPCR等技術目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測——基因是否插入染色體DNA（存在）非轉基因棉花轉基因抗蟲棉陰性對照Marker方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術DNA分子雜交結果圖4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測——基因是否轉錄方法：RT-PCR或DNA分子雜交技術RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖Bt基因在抗蟲棉中的表達從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼Bt抗蟲蛋白4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測——基因是否翻譯為蛋白質方法：抗原-抗體雜交技術蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交4.目的基因的檢測與鑒定個體生物學水平的鑒定——個體是否具有相應性狀方法：抗蟲鑒定、抗病鑒定、抗蟲或抗病接種實驗與天然產品的功能進