基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建都離不開限制性內(nèi)切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準(zhǔn)確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點(diǎn)也是難點(diǎn)，近年來較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進(jìn)行考查。PCR技術(shù)既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測與鑒定，是基因工程中重要技術(shù)之一，其應(yīng)用較強(qiáng)，因此對(duì)PCR技術(shù)的考查也成為命題的熱點(diǎn)。深化提素養(yǎng)1．(2023·全國新課標(biāo)卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、

DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接解析：只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，且E.coliDNA連接酶無法連接酶3切出的平末端，A不符合題意；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，兩者切割后無法相互連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插到質(zhì)粒中，C符合題意；酶2和酶4切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，易導(dǎo)致目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，并且用酶4切割會(huì)破壞標(biāo)記基因，D不符合題意。答案：C

2．(2022·山東高考)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是______________________________________________。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是_________________________________________________________。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是__________________________________。(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是____________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。

(4)根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機(jī)理是_______________________________________________________________。解析：(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，因此設(shè)計(jì)擴(kuò)增P基因的引物需要滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，并且是短單鏈核酸。DNA聚合酶延伸時(shí)，是將脫氧核苷酸添加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的5′端。(2)融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時(shí)出錯(cuò)。由圖可以看出，P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取。解決該問題的修改方案是在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加一個(gè)堿基，使EcoRⅠ識(shí)別序列不影響P基因的正常翻譯。(3)①組僅添加UBC；②組添加UBC和FLAG-P；③組添加UBC、FLAG-P和藥物A；④組添加UBC和FLAG-P△；⑤組添加UBC、FLAG-P△和藥物A。按題中所述處理后，①組沒出現(xiàn)雜交帶，②③組出現(xiàn)雜交帶，③組雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是增強(qiáng)FLAG-P與UBC的結(jié)合。②④組或③⑤組的差異在于②③組含有FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶，④⑤組含有FLAG-P△，沒出現(xiàn)雜交帶，據(jù)此推測P△中缺失的特定序列的作用是參與P與UBC的結(jié)合。(4)根據(jù)(3)的分析推測，藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解，達(dá)到治療該病的目的。答案：(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、短單鏈核酸5′端(2)P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加一個(gè)堿基(3)增強(qiáng)FLAG-P與UBC的結(jié)合參與P與UBC的結(jié)合(4)藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解

知能集成(一)探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。2．根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類3．根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]

玉米是重要的糧食作物，其葉片細(xì)胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長發(fā)育過程中對(duì)水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。科研人員成功培育出超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米，所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示。請(qǐng)回答下列問題：(1)強(qiáng)啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被________________識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，應(yīng)優(yōu)先選用____________________酶組合，將Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T-DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是

___________________________________________________________。(2)將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入______進(jìn)行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，使植物的光合作用和________受到干擾，從而引起植物細(xì)胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對(duì)沒有分化的________團(tuán)，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細(xì)胞可以發(fā)育成__________，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[解析]

(1)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，能驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，則需要強(qiáng)啟動(dòng)子，因此應(yīng)優(yōu)先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，因此T-DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上。(2)由圖可知，標(biāo)記基因是G418抗性基因，因此將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入G418進(jìn)行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，其中葉綠體是光合作用的場所，線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代謝)受到干擾，從而引起植物細(xì)胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對(duì)沒有分化的薄壁細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細(xì)胞可以發(fā)育成胚狀體，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[答案]

(1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上(2)G418呼吸作用(能量代謝)

(3)薄壁細(xì)胞胚狀體[針對(duì)訓(xùn)練]1．(2023·湖北高考)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用Pvu

Ⅰ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用Sph

Ⅰ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用Sph

Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落解析：若用HindⅢ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因不受影響，在含Tet培養(yǎng)基中的菌落可能是含有目的基因的重組質(zhì)粒，也可能是質(zhì)粒自身連接的普通質(zhì)粒，因此，在含Tet培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可分離大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對(duì)數(shù)不同，因此可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；若用SphⅠ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp的培養(yǎng)基中能形成菌落，不能在含Tet的培養(yǎng)基中形成菌落，D錯(cuò)誤。答案：D

2．將小菜蛾細(xì)胞的羧酸酯酶基因(CarE)導(dǎo)入水稻細(xì)胞，培育抗農(nóng)藥水稻新品種，過程如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是

(

)A．必須將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵B．構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質(zhì)粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細(xì)胞D．通過檢測表達(dá)產(chǎn)物來判斷CarE基因在水稻細(xì)胞中是否發(fā)揮功能作用解析：不一定要將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵，但是導(dǎo)入受精卵效果要好，A錯(cuò)誤；Tetr是標(biāo)記基因，是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來，C正確。答案：A

知能集成(二)

PCR技術(shù)中引物的相關(guān)問題分析1．PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較項(xiàng)目PCR技術(shù)DNA復(fù)制場所體外(PCR擴(kuò)增儀中)細(xì)胞內(nèi)(主要是細(xì)胞核內(nèi))解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進(jìn)行需控制溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件合成對(duì)象DNA片段DNA分子相同點(diǎn)均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量2.與引物相關(guān)的問題歸納概括(1)PCR技術(shù)需要引物的原因DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(2)PCR擴(kuò)增中需要引物數(shù)目的計(jì)算規(guī)律若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗引物數(shù)為2n＋1－2，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)。[典例]

IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員利用純合野生鼠應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖1、2。分析回答：(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入_______________________________________________等。(2)在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：引物A5′--CCCCAACCGGAAAGTGTCA--3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′--TAAGCTTCGAACATCCTA--3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識(shí)別序列)引物C5′--GTGAGCTCGCTGCCCCAA--3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識(shí)別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(3)PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30個(gè)循環(huán)。在循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性；循環(huán)中72℃處理的目的是__________________________________。(4)據(jù)圖2分析代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為________________________提供了可能。(5)研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，請(qǐng)你設(shè)計(jì)完成獲得SCID模型鼠的實(shí)驗(yàn)步驟：①雜交親本：______________，雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學(xué)方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，則___________________________________為模型鼠。[解析]

(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應(yīng)含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識(shí)別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開始部位應(yīng)含有限制酶SacⅠ識(shí)別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開始部位應(yīng)含有HindⅢ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性，使DNA雙鏈解開；循環(huán)中72℃處理的目的是使Taq酶從引物起始通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成。(4)代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)存活提供了可能。(5)①研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③模型鼠中應(yīng)含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，若IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶的則為模型鼠。[答案]

(1)Taq酶(或熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C

②

(3)使Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成(4)胚胎在受體內(nèi)存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶[針對(duì)訓(xùn)練]1．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法錯(cuò)誤的是

(

)注：子鏈從引物的3′端開始延伸。A．PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理B．進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶C．利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列D．通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T-DNA的插入位置解析：PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理，是體外擴(kuò)增DNA的一種方式，A正確；PCR中變性過程需要在高溫條件下進(jìn)行，故進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開始延伸，故利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，C錯(cuò)誤；通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T-DNA的插入位置，D正確。答案：C

2．某科研人員從蘇云金芽孢桿菌中獲取Bt毒蛋白基因，并將其導(dǎo)入大豆葉肉細(xì)胞，培育出抗蟲的轉(zhuǎn)基因大豆，主要過程如圖。請(qǐng)回答下列問題：(1)為了正確擴(kuò)增Bt毒蛋白基因，并能與圖中質(zhì)粒正確連接，需根據(jù)__________、____________________________________設(shè)計(jì)兩種引物。PCR時(shí)引物的作用是______________________________________________。(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物_______________不同，可以用__________________________技術(shù)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在，分析可能的原因有________(填選項(xiàng))。解決方案一般是在目的基因的__________(填“內(nèi)部”或“上、下游”)重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。A．引物特異性不強(qiáng)

B．復(fù)性溫度過低C．模板DNA污染

D．引物堿基序列過長(3)圖中①為

，請(qǐng)寫出HindⅢ和BamHⅠ的識(shí)別序列分別是____________________、__________。①②過程所需要用到的酶有____________________。(4)過程③