1《煙草及煙草制品淀粉的測定連續流動法》標準編制說明《煙草及煙草制品淀粉的測定連續流動法》是國家煙草專賣局《關于印發2023年度煙草行業標準項目計劃的通知》（國煙科〔2023〕35號）下達的行業標準制修訂項目，合同號為2023B012，項目經費總預算12萬。項目研究周期為2023年3月~2023年12月。本項目由福建中煙工業有限責任公司牽頭，鄭州煙草研究院、國家煙草質量監督檢驗中心、廣東中煙工業有限責任公司、河南中煙工業有限責任公司、江蘇中煙工業有限責任公司、中國煙草總公司福建煙草省公司、湖北中煙工業有限責任公司等共同承擔。福建中煙工業有限責任公司負責項目總體方案制定、資料收集整理、方法開發研究、共同試驗樣品收集與檢測、項目試驗報告匯總、項目的總體標準文本的起草、標準的意見征求等。其他承擔單位參與項目方案設計、項目實施過程研究、參與共同實驗等工作。本項目下達后，項目組制定了項目的實施方案，并分四個階段完成標準制定工作。第一階段：文獻調研項目組通過查閱煙草淀粉相關的國內外標準、規范、技術文獻等資料，根據研究對象煙草及煙草制品的基質特性，結合行業現狀考察有關方法的適用性，確定了本項目的總體技術方案和研究的基本方法。第二階段：方法研究2023年3月-9月，項目組根據文獻調研和前期實驗結果形成技術方案，對分析方法進行了完善和優化。首先通過文獻資料的研究與驗證實驗表明，用離心管+抽濾裝置替代G3砂芯漏斗，使試樣前處理可大批量進行；然后改進煙草試樣淀粉萃取的萃取液，采用90%二甲亞砜-鹽酸（0.25mol/L）萃取液萃取試樣中淀粉，以避免40%高氯酸溶液在萃取淀粉過程中，可能因酸解而導致檢測結果不穩定的問題，并優化了萃取過程參數。對改進后的方法與原標準方法進行了比對試驗，同時進行了方法學考察，包括精密度，檢出限，回收率等。第三階段：實驗比對階段2023年10月-11月，制定了共同實驗方案并組織福建中煙工業有限責任公司、中國煙草總公司鄭州煙草研究院、國家煙草質量監督檢驗中心、廣東中煙工業有限責任公司、河南中煙工業有限責任公司、中國煙草總公司福建煙草省公司、湖北中煙工業有限責任公司等7個實驗室進行了方法的驗證比對實驗。實驗結果表明：7家實驗室的8個樣品的檢測結果RSD在10%以內，表明各實驗室間數據比對良好。第四階段：形成征求意見階段2023年12月，撰寫了項目試驗研究報告，完成了標準方法初稿的起草工作，并將標準方法初稿及項目試驗研究報告提交給項目協作單位的相關成員進行審閱，根據反饋意見對標準方法初稿進行進一步的修改和完善，形成了標準征求意見稿。主要起草人有：本標準項目負責人為XXX，項目組其他人員為承擔單位參加該項技術研究的專業人員，主要負責標準起草、組織協調、樣品收集、方案設計、方法驗證等工作。2、相關領域的國、內外標準研究和制修訂情況經檢索目前對煙草及煙草制品中淀粉的檢測方法標準主要有：YC/T283-2009《煙草及煙草制品淀粉的測定酶解-離子色譜測定法》和YC/T216-2013《煙草及煙草制品淀粉的測定連續流動法》。YC/T283-2009因酶制劑等穩定性制約，使用率較低；現行方法YC/T216-2013是在原標準YC/T216-2007（已廢止）基礎上進行修訂，目前在行業內檢測部門普遍使用。3、標準編制原則及主要內容確定的依據本標準規定了煙草及煙草制品中淀粉含量的連續流動分析測定方法。本標準適用于煙草及煙草制品中淀粉的測定。標準的編制原則是：達到國際標準先進水平，同時考慮國內的實際情況，在不影響方法準確性和先進性的前提下，盡量簡化操作，提高檢驗效率。本標準主要內容包括：1范圍；2規范性引用文件；3原理；4試劑；5儀器和材料；6分析步驟；7結果計算與表述；8方法重復性及回收率；9試驗報告。本標準參考了國內外相關方面的最新文獻，按照《化學類標準制修訂方法補充規定》的要求，結合煙草基質實際成分，考慮行業相關企業具體情況，方法推廣的難易程度，通過根據科學嚴謹的試驗設計和反復試驗結果確立了二甲亞砜-鹽酸萃取的檢測體系，修訂了煙草及煙草制品中淀粉的測定方法-連續流動法，確定的依據包括方法優化和方法驗證兩部分，具體如下：現行標準YC/T216-2013采用G3燒結玻璃砂芯漏斗作為萃取和分離的裝置，可實現萃取和固液分離。通過調研，砂芯套管、離心管+抽濾裝置也能實現同樣功能。項目組對三種裝置的萃取和分離效果進行試驗考察。不同種類煙葉三種裝置的檢測結果無明顯差異，且平行檢測結果RSD均小于5%。但在多次使用后發現，G3砂芯漏斗使用過程中易堵塞，且實驗后需用重鉻酸鉀洗滌，存在環保安全方面的問題；采用砂芯套管堵塞有所改善，但內外管液體無法交換，存在死體積，不同批次套管的死體積不同，存在不可控因素，不利于標準推廣；而采用離心管+抽濾裝置清洗方便，不存在煙末殘留，且離心管體積小，便于大批量前處理。項目組采用離心管+抽濾裝置方式，在實驗操作環節，改進了煙草淀粉測定過程試樣萃取裝4置及操作，解決了G3砂芯漏斗不好清洗，多次使用后易堵塞，影響檢測結果的問題，提高了實驗的批量操作性和檢測結果的穩定性。煙草中含有色素、醌類等物質，對碘-淀粉顯色物的比色測定產生干擾?，F行標準YC/T216-2013采用0.25g試樣用25mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液一次萃洗去除試樣中色素等，在實踐過程中，發現部分煙葉不能完全去除色素等干擾。通過系列設計試驗發現，提高80%乙醇-飽和氯化鈉溶液至30mL醇洗1次，能完全去除色素等干擾。因此，在去色素干擾環節，項目組增加80%乙醇-飽和氯化鈉溶液的用量，確保了不同煙草及煙草制品類型試樣能夠完全去除色素干擾。（1）考察高氯酸對淀粉萃取影響。標準YC/T216-2013采用40%高氯酸作為萃取劑，項目組通過試驗考察了40%高氯酸對淀粉酸解影響和對煙草中部分大分子的溶出影響。結果發現，采用高氯酸萃取煙草試樣淀粉，在萃取過程中可能伴隨淀粉的酸解和將部分大分子物質酸解帶出，從而影響檢測結果的準確性。同時，新版的公安部《易制爆危險化學品名錄》（2017版）將高氯酸納入了管控名錄，高氯酸藥品的購買、存放、使用受限，對檢測帶來了不便與制約，因此，擬對萃取劑進行替代優化。（2）萃取劑的替換。通過文獻調研發現，90%二甲基亞砜水溶液具有能完全萃取試樣中淀粉、不發生酸解、穩定保存、滿足環保要求等多方面的優點。但DMSO溶解淀粉時，淀粉易發生快速溶脹會阻止DMSO穿透整個淀粉顆粒，為提高淀粉在DMSO中的溶解性，使用DMSO溶解淀粉時需加入少量的水抑制淀粉顆粒凝膠層的形成，采用90%二甲基亞砜/水溶液50℃振蕩萃取12h淀粉萃取率可達97.15%以上。此外，文獻調研還發現，由于細胞壁對細胞內淀粉萃取起到一定阻隔作用，為加快試樣中淀粉的萃取完全，在90%二甲基亞砜-水溶液萃取劑中加入適量鹽酸，有助于超聲振蕩對細胞酸化破壁，從而加快二甲基亞砜溶液進入細胞內進行淀粉萃取，5極大提高萃取淀粉的效率。項目組借鑒文獻方法，經反復試驗確定采用90%二甲基亞砜-鹽酸（0.25mol/L）溶液替代高濃度的高氯酸溶液作為萃取劑，改進其在煙草中的應用效果。（3）萃取條件優化。項目組在確定萃取劑試驗過程中，同時還通過設計不同試驗，優化了萃取時間、萃取溫度、萃取體積等萃取條件，最終確定淀粉萃取最佳條件：采用90%二甲基亞砜-鹽酸（0.25mol/L）溶液替代高濃度的高氯酸溶液作為萃取劑，稱取025g試樣，加入40mL萃取劑，在60℃溫度下，超聲萃取45min。根據文獻，淀粉在pH≤4酸性條件下碘顯色最佳。由于試樣前處理已不再用高氯酸萃取，上機所用15%高氯酸溶液可用鹽酸等其它酸性溶液代替，以契合實驗管理、試劑安全環保等要求。通過實驗驗證，采用15%高氯酸溶液和用1M的鹽酸溶液檢測和結果無明顯差異，因此，在連續流動分析環節，采用1mol/L鹽酸替代高氯酸保持分析過程的酸體系平衡，實驗過程更加綠色環保。本部分采用JJF1343-2022《標準物質的定值及均勻性、穩定性評估》[30]中有關穩定性研究方法對檢驗數據進行評估。取95%的置信區間，若|b1|<t0.95,5×s(b1)，說明試樣的濃度對時間變量無明顯差異，試樣穩定性良好。實驗結果表明：標準儲備溶液31天內穩定性良好，儲存條件確定為：在0℃~4℃下避光密閉保存，有效期一月；前處理后試樣待測液中淀粉24小時內穩定性良好。項目組根據確定的檢測方法，采用90%二甲基亞砜-鹽酸溶液配制標準溶液，考察標準溶液線性，相關系數R=0.9998，線性關系良好；對精密度、回收率等指標進行了嚴謹細致的試驗，日內RSD（%）在1.12%~2.08%之間，日間RSD（%）在1.80%~2.53%，均小于5.0%；試樣加6標回收率在96.6%～101.5%之間，方法的重復性良好，檢測方法準確、可靠，滿足檢測要求。項目組按照GB/T6379-2009標準要求，組織7家實驗室開展了8個不同類型煙草試樣的淀粉含量測定共同實驗研究。實驗室間不同煙草類型的檢測結果RSD在1.59%~7.93%之間。項目組采用修訂方法及現行標準（YC/T216-2013）方法對8個不同類型試樣進行了淀粉含量檢測，檢測結果相對標準偏差在0.64%~4.35%之間，都在5%以內，表明兩種方法檢測結果比較吻合。采用兩種方法分別進行100個試樣的批量檢測，考察兩種方法前處理過程的時間效率，試驗結果表明，修訂方法的前處理效率是YC/T216-2013標準方法的前處理效率的3倍左右。經方法驗證試驗表明，修訂方法穩定性和重復性好、準確性和精確性高，且該方法簡便，快捷，適用于大批量檢測，易于在行業內推廣，可應用于煙草和煙草制品中淀粉含量的分析測定。具體情況詳見項目技術報告。4、標準預期產生的社會、經濟效益淀粉是影響煙草品質的重要物質，一直是煙草質量評價的重要指標。適宜的淀粉含量是提高卷煙香、吃味質量的重要指標，但較高的淀粉將會影響煙草的燃燒性能，產生的刺激性、焦糊氣味和雜氣等，對煙草的色、香、味產生不良影響。因此，測定調制前后煙葉中的淀粉含量已成為煙草品質評價的重要指標之一，建立簡便、快速、準確測定煙草中淀粉的分析方法，是完善煙草化學成分分析的一項基礎性工作。本標準的制定為煙草及煙草制品中淀粉含量的測定提供技術支持，以規范煙草及煙草制品中淀粉分析方法，通過合理調控煙草中淀粉含量，從而提高卷煙產品感官質量。5、采用國際標準和國外先進標準的情況7目前沒有關于煙草及煙草制品中淀粉含量的連續流動測定法的相關國際標準和國外先進標準，因此沒有進行采用。6、與有關的現行法律、法規和強制性標準的關系本標準符合現行有關法律、法規和強制性標準的要求。7、重大分歧意見的處理經過和依據本標準在制定過程中未出現重大的意見分歧。8、作為強制性標準或推薦性標準的建議及主要依據鑒于目前煙草行業內檢測手段、儀器設備以及相關技術的現實情況，本標準選取方法準確可靠、操作簡便、易推廣，建議作為推薦性行業標準，提供給各卷煙企業及相關研究中心等檢測部門。9、標準宣貫的要求和措施建議本標準發布后，建議由國家煙草專賣局牽頭組織標準宣貫，在煙草企業、煙草質檢系統進行標準宣貫培訓，要求具備一定理論基礎的技術人員或檢驗人員參加，以授課形式即可推廣。10、廢止現行有關