PCR技術的原理與方法鐘召迪PCR定義聚合酶鏈反響(PolymeraseChainReaction)簡稱ＰＣＲ，是一項在短時間內大量擴增特定的ＤＮＡ片段的分子生物學技術。是指在DNA聚合酶的催化下，以母鏈DNA為模板，一特定引物為延伸起點，經過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出于母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。可用于基因別離克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等。PCR反響特點特異性強靈敏度高簡便、快速對標本的純度要求低PCR技術的根本原理PCR的反響成分PCR的反響根本步驟PCR的反響體系PCR的反響成分

模板DNA引物四種脫氧核糖核苷酸DNA聚合酶反響緩沖液，Mg2PCR的反響根本步驟

PCR的反響根本步驟變性：高溫使雙鏈DNA解離成單鏈〔94℃，30s〕退火：低溫下，引物與DNA模板互補區結合〔55℃，30s〕延伸：中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起點的DNA鏈延伸反響〔70~72℃，30~60s〕PCR的反響體系10×擴增緩沖液1/10體積

4種dNTP混合物各200umol/L

引物(2個)0.2umol/L

模板DNA102～105

TaqDNA聚合酶1～2.5單位/反響體系

Mg2+1.5～2.5mmol/L

加雙或三蒸水至25～50ulPCR反響五要素引物〔primer〕酶〔TaqDNApolymerase〕dNTP〔dATP,dGTP,dCTP,dTTP〕模板〔template〕Mg2+〔magnesium〕引物引物是PCR特異性反響的關鍵PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增引物設計的原那么引物最好在模板cDNA的保守區內設計引物長度一般在15~30堿基之間引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃引物3′端要避開密碼子的第3位引物3′端不能選擇A，最好選擇T堿基要隨機分布引物自身及引物之間不應存在互補序列引物設計的原那么引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾擴增產物的單鏈不能形成二級結構引物應具有特異性酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供給天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反響約需酶量2.5U〔指總反響體積為100ul時〕濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低那么合成產物量減少DNTP的質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系dNTP呈顆粒狀，保存不當易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。屢次凍融會使dNTP降解在PCR反響中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等〔等摩爾配制〕，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時〔偏高或偏低〕，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低模板〔靶基因，TARGETGENE〕模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸MG2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響在一般的PCR反響中，各種NTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反響特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反響產物減少PCR反響條件的選擇PCR反響條件:溫度時間循環次數溫度與時間的設置設置變性-退火-延伸三個溫度點標準反響中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因〔長度為100～300bp時〕可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸變性溫度與時間變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性假設低于93℃那么需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步假設不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗退火(復性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合時機遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想延伸溫度與時間延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸反響時間：根據待擴增片段長度而定1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min〔足夠〕3～4kb的靶序列需3～4min擴增