鎖陽藥材hplc指紋圖譜和有效成分含量測定

cykorrizan是cykorrizan科的一種寄生植物。它通常生長在位于栽培植物白刺（nidaribircam）的干燥部位。主要生長于干燥和堿性沙地。主要產于內蒙古、新疆、甘肅、青海等西北地區。鎖陽味甘、性溫,具有補腎、助陽、益精、潤腸養筋之效用,中醫用于治療陽痿、遺精、不孕、腰膝酸軟、腸燥便秘等。現代藥理學研究表明:鎖陽具有提高機體免疫力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒(HIV)、抑制血小板聚集和雌激素樣等多種藥理活性。鎖陽中的化學成分主要有有機酸、黃酮類、酚類、甾體類、三萜類、鞣質、糖苷等多種成分,其中黃酮類成分具有提高機體免疫力、清除自由基的活性。近年來,指紋圖譜技術已被許多國家和國際組織用于天然產物的質量控制,尤其是HPLC指紋圖譜,已廣泛用于中藥的鑒別和質量控制,并取得重要的進展。本文利用HPLC建立鎖陽指紋圖譜,并建立同時測定鎖陽中有效成分兒茶素、根皮苷的方法,為鎖陽質量控制和有效利用提供參考。1儀器、試劑和材料1.1高效液相色譜儀儀:dz體調溫熱電套,as-ap18-一種RE-52C型旋轉蒸發儀(鞏義市英峪予華儀器廠);SHZ-DⅢ型循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);DZTW型調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠);Agilent1200高效液相色譜儀(AgilentTechnologies,USA),包括G1312ABinarypump,aG1315BDAD,G1328BManualinjector,Autosampler,AgilentChemstationsoftware;ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大連依利特分析儀器有限公司)。1.2標準試驗劑:siga兒茶素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號:877-200001),根皮苷對照品(美國Sigma公司,批號:083K7072);乙腈為色譜純(山東禹王實業集團禹城化工廠),其它試劑均為分析純,純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。鎖陽樣品由中科院蘭州化物所戚歡陽副研究員鑒定為鎖陽科植物鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.的肉質莖(樣品信息見表1)。2方法和結果2.1樣品溶液和對照溶液的制備2.1.1超聲-濾渣法將鎖陽樣品粉碎,過40目篩,準確稱取2g,置于具塞三角瓶中,加入15ml甲醇,在溫度為40℃,頻率為50kHz條件下超聲30min后,抽濾。濾渣再同法提取2次,合并3次濾液,濃縮至近干,加入甲醇溶解轉移定容至5ml容量瓶中,備用。臨用前取上清液,經0.45μm濾膜過濾后進樣分析。2.1.2%/ml和0.“ml”溶液精密稱取兒茶素和根皮苷對照品適量,分別用甲醇溶解定容到容量瓶中,配成濃度分別為0.6020mg/ml和0.1936mg/ml溶液。分別精密量取上述溶液各1ml,置5ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到濃度分別為0.1204mg/ml(兒茶素)和0.0387mg/ml(根皮苷)的混合對照品儲備液,備用。2.2流動相-乙腈相法色譜柱為ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大連依利特分析儀器有限公司);流動相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫:0～20min,10%～40%(A),20～60min,40%(A);流速1.0ml/min,檢測波長280nm,柱溫為室溫,進樣體積20μl,自動進樣器進樣。2.3鎖陽指紋圖譜的建立對上述條件下的液相色譜指紋圖譜分析比較和對已知化合物的確認,并將色譜信息通過相似度軟件計算,從10個樣品的色譜信息中獲取共有峰,建立鎖陽指紋圖譜,見圖1。共有峰的相對保留時間、相對峰面積見表2～3。2.4重復性和線性范圍取1#樣品溶液,連續進樣5次,測得各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值均小于5%。其中:兒茶素和根皮苷的相對保留時間的RSD值分別為0.18%和0.32%(n=5),相對峰面積的RSD值分別為0.97%和2.18%,表明精密度良好。取1號樣品6份,分別精密稱定,按照“2.1”項方法制備樣品溶液,利用“2.3”項建立的色譜條件進樣分析,測得每份樣品中各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于5%。其中:兒茶素和根皮苷的相對保留時間的RSD值分別為1.42%和2.16%(n=5),相對峰面積的RSD值分別為1.94%和2.95%,表明其重復性較好。2.4.4線性關系、相關系數和線性范圍分別精密量取等量的兒茶素、根皮苷對照品溶液,均勻混合后,用自動進樣器分別吸取對照品溶液1,2,5,10,15,20μl,利用“2.3”項建立的色譜條件進樣分析。以對照品進樣量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性回歸,分別得到兒茶素和根皮苷的線性關系、相關系數和線性范圍:Y=70.992X-31.927,r=0.9996,0.1024～3.612μg(n=3);Y=91.91X-8.7264,r=0.9998,0.0387～1.1616μg(n=3)。2.5加樣回收率測定總成分配比的確定精密稱取適量已知含量的鎖陽樣品6份,分別加入適量兒茶素和根皮苷的對照品,按照“2.1”項方法制備樣品溶液,利用“2.3”項建立的色譜條件進樣分析,測定兒茶素和根皮苷的平均回收率分別為100.5%(RSD=1.87%),99.3%(RSD=2.54%)。結果見表4。3討論3.1樣品預處理和色度條件的優化3.1.1提取條件的篩選分別考察了50%甲醇、甲醇和乙醇3種提取溶劑。經考察發現50%甲醇、乙醇作為提取溶劑時,提取物中成分復雜,干擾兒茶素與根皮苷的分離。甲醇作為提取溶劑既能提取所需要的成分,又能減少大量其它物質的干擾,所以選擇甲醇作為提取溶液。以甲醇為提取溶劑,分別考察了回流提取法、超聲提取法、索氏提取法對提取的影響。研究表明:在溫度為40℃,功率為50kHz的超聲提取條件下含量最高,并且操作簡單方便。在此基礎上利用正交實驗優選了最佳提取條件,正交實驗結果見表5。由表5可知:所得最佳提取條件為2g藥材超聲提取3次,每次加入15ml甲醇,每次提取30min。3.1.2流動相及色譜波長的選擇為了選擇適宜的檢測波長,以便最大限度獲取色譜信息滿足建立指紋圖譜的需要,同時,還要兼顧兩個主要成分的測定,分別在230,254,280,360nm波長處考察色譜信息,最終選擇280nm為檢測波長。在選擇流動相時,發現兒茶素只有在流動相極性很大的條件下才能完全分離,根皮苷卻要在有機相比例較大的條件才能有效分離,所以采用梯度洗脫。再比較甲醇水體系和乙腈水系統,發現乙腈水體系分離效果好于甲醇水體系。3.2地域間不同地域間藥材互作中兒茶素和根皮苷含量差異大,當地供熱體中兒茶素的含量大,當地分布差不同產地鎖陽中兒茶素與根皮苷的含量測定結果見表6。結果發現青海海西州的含量最高,內蒙古巴盟的含量最低,各產地藥材中兒茶素與根皮苷的含量差異大,這可能是不同地域生態環境的差異導致其中次生代謝產物有較大差別。2.4.1穩定性試驗結果取1號樣品溶液,分別在