2起食物中毒中副溶血性弧菌基因特征分析

嗜鹽細菌（vp）廣泛分布于生活在太平洋、魚類、其他礦產、食品和外部環境中。由于它喜歡鹽，它對溫度有很大的影響。副溶血性弧菌是導致人類急性胃腸炎的重要病原菌,尤其在沿海地帶,它是細菌性食物中毒的重要病原菌。以往食物中毒檢測時存在著同1份病例或食品樣本中分離到的副溶血性弧菌往往有幾個血清型的狀況,但這些血清型之間是否存在遺傳相關性,是否屬于同一克隆組(clonecomplex),目前較少資料報道。1996年后O3:K6在全世界范圍內流行,并出現了O4:K68、O1:K25、O1:KUT等脈沖場凝膠電泳(PFGE)圖譜與O3:K6十分接近的菌株,形成了O3:K6克隆群,被稱為大流行株(pandemicstrain),與1996年以前的O3:K6菌株在toxRS基因上有7個堿基的不同,根據這一不同,GS-PCR方法被創建起來,用于區分新舊O3:K6克隆群。orf8可能編碼1種粘附蛋白,能增加副溶血性弧菌粘附于人類腸道細胞的能力或增加了其粘附于海生植物表面的能力,也是大流行株的判斷標志之一。副溶血性弧菌臨床分離株多數可產生1種耐熱直接溶血素(TDH),可以裂解我妻氏血平板上的紅細胞,產生溶血環,是目前所知的副溶血性弧菌主要的毒力因子,另外一種TDH相關溶血素TRH被認為與脲酶的產生有關,也被認為是副溶血性弧菌的毒力因子之一。資料顯示,多數臨床分離株攜帶tdh基因,不攜帶trh基因。本文從血清學分型、毒力基因攜帶情況(tdh和trh基因)、大流行株判斷(GS-PCR和orf8基因陽性)、PFGE分型等多方面分析,對2起食物中毒中相同樣本不同血清型的副溶血性弧菌進行基因特征分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1該菌株的來源1.1.3主要設備和分析軟件1.2方法1.2.1抗蟲菌的副溶血鑒定1.2.2中毒基因檢測1.2.3g-pcr和或f8基因檢測1.2.4PFGE2結果2.1生化鑒定結果第2起食物中毒共采集到12份樣本,經過分離培養,每份樣本挑取10個可疑菌落,共挑取120個可疑菌落進行生化和血清學鑒定,其中副溶血性弧菌80株,其中O3:K644株,O4:K8、O11:K36、O11:K19各10株,O1:K566株,非副溶血性弧菌40株,見表3。2.2遺傳因子和trh2.3基因或gs-pcr和f8的隨機性2.4pfga的結果2.4.1第一位中毒的pfga的結果2.4.2第二種是中毒的pfga的結果2.4.32.o3：k6中毒的pfga3水煮魚體內各基因共感染試驗本研究中同1份食品樣本最多分離到3種血清型的副溶血性弧菌,同1份肛拭中最多分離到2種血清型,說明副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,如果僅挑取1個可疑菌落容易造成漏檢。以第1起食物中毒為例,共有17個不同的血清型(不同樣本中血清型個數相加),如果每份標本僅挑取1個可疑菌落,將分離到11個血清型,血清型漏檢率35.3%(6/17),以此類推,如果每份標本分別挑取2、3、4、5個可疑菌落,將分離到11、13、14、16個血清型,血清型漏檢率分別為35.3%(6/17)、23.5%(4/17)、17.6%(3/17)、5.8%(1/17),只有每份標本挑取12個可疑菌落,才能分離到目前已知的所有血清型,綜合成本-效益分析,本研究認為每份樣本可以考慮挑取5個可疑菌落。本研究發現,副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,那么,相同樣本中分離的不同血清副溶血性弧菌是否有遺傳關系,其遺傳特征是否一致?現對基因特征分析如下。第1起食物中毒中,3份肛拭子中(1-8,1-9,1-10)同時檢出O3:K6和O2:K28。結果顯示,O3:K6攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,GS-PCR和orf8基因陽性,屬大流行株,O2:K28不攜帶tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因陰性,不屬于大流行株。PFGE顯示O3:K6和O2:K28有7個以上條帶變化,根據Tenovar原則,O3:K6和O2:K28為遺傳不相關菌株。水煮魚(1-3)分離到3種血清型的副溶血性弧菌,O2:K28,O3:K25和O4:K12,它們不攜帶tdh和trh毒力基因,GS-PCR和orf8基因陰性,PFGE顯示,3種不同血清型的菌株有7個條帶以上的變化,為遺傳不相關菌株。第2起食物中毒中,餐盤涂抹樣(2-5)和肛拭子(2-6)都檢出O3:K6和O1:K56,O3:K6和O1:K56都攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,但O3:K6的GS-PCR和orf8基因陽性,屬大流行株,O1:K56的GS-PCR和orf8基因陰性,不屬于大流行株,PFGE顯示O3:K6和O1:K56有7個以上條帶變化,為遺傳不相關菌株。就本次研究顯示,來自相同樣本不同血清型的副溶血性弧菌屬于不同克隆,為遺傳不相關菌株。第1起食物中毒中,食品(1-1、1-2、1-3)和肛拭(1-8、1-9、1-10)中都分離到O2:K28,它們都不攜帶tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因陰性,且PFGE帶型基本一致,屬于高度相關菌株。結合流行病學資料,可以證明患者是食用了該食品受到感染。雖然O2:K28不攜帶tdh和trh毒力基因,但細菌的大量繁殖也會導致腹瀉等癥狀,或者O2:K28有尚未發現的致病因子。即使每份樣本挑取20個菌落,仍然不能找到病人肛拭中O3:K6的感染來源,說明單純靠多挑可疑菌落是不行的,或者感染來源并不限于這3種食品,還有其他感染來源未找到。另一原因可能是,非O3:K6菌株進入人體后,發生了基因水平轉移,轉變成O3:K6。Bhoopong等發現6株副溶血性弧菌分別在小鼠體內傳代50次,其中有3株菌從O11:KUT轉變成O11:K15,但毒力不發生改變,而在體外傳代50次,血清型和毒力都不會發生改變,說明副溶血性弧菌在體內復制過程中血清型的變異是可能發生的。第2起食物中毒中,從鹵雞蛋盤涂抹樣(2-5)中分離到了O3:K6和O1:K56,與病例分離的O3:K6和O1:K56各有1條帶的差異,屬高度相關菌株,推測是本次食物中毒的污染源。肛拭子(2-10)分離到O4:K8,攜帶tdh毒力基因,不屬于大流行株,推測屬于不同傳染源的感染。O11:K36攜帶tdh毒力基因,GS-PCR和orf8的結果顯示屬于大流行株,PFGE顯示,與O3:K6有5條帶的差異,為可能相關菌株。鹵雞蛋(2-1)中分離到的O11:K19,不攜帶tdh和trh基因,不屬于大流行株,PFGE帶型與O3:K6、O4:K8等也不一致,屬于不相關菌株,不能證明與本次食物中毒有關。綜上所述,前后2起食物中毒分離的O3:K6都是tdh陽性、trh陰性、GS-PCR和orf8陽性,PFGE帶型一致,屬于大流行株。沙門菌H9812,作為PFGE的分子量標準,由中國疾病預防控制中心傳染病所惠贈。1.1.2血清型菌株的篩選和pfge分析副溶血性弧菌瓊脂(上海市疾病預防控制中心),副溶血性弧菌診斷血清(日本生研株式會社),SeaKemGoldAgarose(美國CambrexBioScienceRockland),XbaI、NotI限制性內切酶(大連寶生物公司),蛋白酶K(上海生工),一步法PCR試劑盒(上海生工)。VITEKDENSICHEK濁度儀(法國BioMérieux公司),恒溫水浴搖床(英國GRANT公司),脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-RadCHEFMapper),凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),BioNumerics圖像分析軟件(比利時)。第1起食物中毒發生在2010年5月17日深圳市南山區某電子有限公司食堂,員工用餐后發生腹瀉、腹痛癥狀,感染人數有20人左右,采集到病人肛拭子9份,可疑食品3份,按照GB/T4789.7—2008食品衛生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗的要求,分別接種3%NaCl堿性胨水,37℃培養18h,劃線副溶血性弧菌瓊脂,37℃培養24h,每個平板上挑取20個可疑菌落,進行鹽耐受試驗、生化試驗和血清學鑒定。第2起食物中毒發生在2010年7月1日深圳市南山區某配餐中心,客人用餐后發生腹瀉、腹痛癥狀,感染人數有10人左右,采集到病人肛拭子7份,可疑食品2份,涂抹樣3份,經過上述相同的步驟,每個平板上挑取10個可疑菌落。參考文獻進行。每份樣本挑選不同血清型的菌株各1株,水煮法提取DNA,采用多重PCR擴增tdh和trh基因。引物見表1。參考文獻進行。采用1.2.2中提取的DNA,進行以下試驗。GS-PCR在25μL反應體系中進行:5μLDNA,12.5μL2×PCR緩沖液,引物各0.25μL(10mmol/L),以及7μL滅菌蒸餾水。反應條件:96℃預變性5min,96℃變性1min,45℃復性2min,72℃延伸3min,25個循環,最后延伸72℃7min。引物見表1。參考文獻進行。從2起食物中毒中挑取代表菌株,每份樣本的每種血清型至少1株,進行PFGE。采用40U限制性內切酶NotI于37℃酶切4h。H9812用XbaI50U37℃酶切2h作為分子量標準。電泳參數:電壓6V/cm,電場夾角120°,起始轉換時間10s,終末轉換時間35s,電泳18h。用凝膠成像軟件Quantityone-4.4.0獲取圖像,BioNumerics4.0分析圖像,聚類分析采用非加權組平均法(unweightedpairgroupmethodwithaverages,UPGMA)方法和Dice系數,按tolerance1.5%,optimization1.5%繪制聚類圖。第1起食物中毒共采集到12份樣本,經過分離培養,每份樣本挑取20個可疑菌落,共挑取240個可疑菌落進行生化和血清學鑒定,副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌分別為180和60株,其中O3:K6107株,O2:K2870株,O4:K34、O3:K25、O4:K12各1株,見表2。第1起食物中毒中,11份樣本中挑出17株菌進行毒力基因檢測,分別是8株O3:K6、6株O2:K28、1株O4:K34、1株O3:K25、1株O4:K12,結果顯示,8株O3:K6攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,其他血清型tdh和trh基因都不攜帶,見圖1。第2起食物中毒中,8份樣本中挑出10株菌進行毒力基因檢測,分別是5株O3:K6、2株O1:K56、1株O4:K8、1株O11:K36、1株O11:K19,結果顯示,除O11:K19不攜帶tdh和trh基因外,其他9株菌都攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,見圖2。第1起食物中毒中,8株O3:K6GS-PCR和orf8基因陽性,其他血清型GS-PCR和orf8基因陰性(圖1)。第2起食物中毒中,5株O3:K6和1株O11:K36GS-PCR和orf8基因陽性,其他血清型GS-PCR和orf8基因陰性(圖2)。第1起食物中毒中,3份食品樣和3份肛拭子均分離到O2:K28,PFGE顯示,其中5株O2:K28的帶型一致,1株O2:K28(1-10-3)的帶型與其他5株不一致。8份肛拭子中都分離到O3:K6,PFGE帶型一致,O3:K6與O2:K28、O4:K12、O3:K25的帶型均不一致,見圖1。其中O4:K34由于復蘇時污染,未做PFGE。