淺談新生代的親屬因子

1987年，laskey通過對(duì)兩組蛋白素和dna的外部生理強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，需要在內(nèi)核中含有一些酸性蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化為核小型體。否則，就會(huì)沉淀，提出了最初的分子伴侶概念。后來,Ellis在研究高等植物葉綠體中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,即在葉綠體中合成的8個(gè)大亞基以及在細(xì)胞質(zhì)中合成的8個(gè)小亞基,都必須先和一種蛋白結(jié)合后,才能在葉綠體內(nèi)組裝成活性酶分子。因此提出在普遍意義上幫助新生肽鏈折疊的分子伴侶概念。1993年Ellis對(duì)分子伴侶的定義是:分子伴侶是一類相互之間有關(guān)系的蛋白,它們的功能是介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確的折疊與裝配,但并不構(gòu)成被介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的組成部分。現(xiàn)今這個(gè)概念已得到了補(bǔ)充和發(fā)展。1分子落實(shí)論co-so的結(jié)構(gòu)與功能目前認(rèn)為,分子伴侶(molecularchaperone)是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象,并能通過有控制的結(jié)合和釋放,促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、修飾、裝配、以及錯(cuò)誤多肽鏈的降解。應(yīng)該指出的是,分子伴侶是從功能上定義的,凡具有這種功能的蛋白質(zhì)都是分子伴侶,它們的結(jié)構(gòu)可以完全不同。這一概念目前已延伸到許多蛋白質(zhì),現(xiàn)已鑒定出來的分子伴侶主要屬于幾類高度保守的蛋白質(zhì)家族,其成員廣泛分布于原核及真核細(xì)胞中。其中大部分成員屬于熱體克蛋白(heatshockprotein,Hsp),根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能的差異,分子伴侶包括幾個(gè)結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的蛋白質(zhì)家族:Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、SmallHsps(smHsp)、鈣聯(lián)接蛋白(Calnexin)、TCP-1環(huán)復(fù)合體(TCP-1containingringcomplex,TRiC)、核漿素(Nucleoplasmin)、輔助分子伴侶Co-chaperone(DnaJ、GroES、Cpn10)和折疊酶等。其中研究比較清楚的是Hsp70/DnaK和Hsp60/GroE系統(tǒng),尤其對(duì)后者即伴侶因子的研究進(jìn)展較快,已在Cell,Nature等重要雜志先后報(bào)道,本文綜述如下。2真核生物中的小體糖1,5-二磷酸羧化酶抑制劑清髓工酶的結(jié)構(gòu)及分布伴侶因子是一種普遍存在的蛋白質(zhì)家族,一般結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)圓環(huán)背靠背組成的一個(gè)大圓柱體,每個(gè)圓環(huán)是由具有ATP酶活性的分子量約60kD的亞基構(gòu)成。圓柱體中央的空腔是蛋白質(zhì)折疊的重要場(chǎng)所,它提供了底物蛋白折疊所需的封閉環(huán)境,參與協(xié)助其它蛋白質(zhì)多肽的折疊修飾等。根據(jù)伴侶因子來源及同源性的特點(diǎn)可將其分為兩大組:第一組(GroupI)伴侶因子存在于細(xì)菌及真核生物中的內(nèi)生同源細(xì)胞器(線粒體和葉綠素),成員包括細(xì)菌內(nèi)的GroEL、真核生物線粒體中的Hsp60(Cpn60)以及葉綠體中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶結(jié)合蛋白(RubiscoBondingProtein)。第二組(GroupII)伴侶因子存在于古細(xì)菌及真核生物的胞質(zhì)中,成員有古細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)的溫度傳感器(Thermosome)和嗜熱因子55(thermophilicfactor55,TF55),以及真核生物胞質(zhì)內(nèi)的含有TCP-1的伴侶因子(chaperonincontainingTCP-1,CCT),也稱為TCP-1環(huán)復(fù)合體(TCP-1containingringcomplex,TRiC)。2.1第一組離婚因素這一組伴侶因子中尤以對(duì)大腸桿菌中的GroEL的結(jié)構(gòu)、功能研究較為詳細(xì),促進(jìn)了人們對(duì)伴侶因子的認(rèn)識(shí)和了解。2.1.1groel亞單元的結(jié)構(gòu)及其與合成肽的關(guān)系早在1978年,Georgopoulos等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌中的λ噬菌體生長(zhǎng)時(shí),必須有GroE的存在,GroE系統(tǒng)是由GroEL及其它的輔助分子伴侶GroES組成。GroEL蛋白是同型寡聚復(fù)合物,由14個(gè)相對(duì)分子量為57kD的亞基組成;GroES是由相對(duì)分子量為10kD的亞基組成的七聚體環(huán),連在GroEL的末端。GroEL的電鏡圖像顯示其圓柱體狀的顆粒中有一個(gè)中央腔,腔內(nèi)可以被底物多肽占據(jù)。Braig等用X-ray結(jié)構(gòu)分析得到了GroEL更加清晰的圖像,證實(shí)GroEL分子類似一個(gè)直徑137,高146的圓筒(?=10-10m),它的14個(gè)亞基背靠背構(gòu)成兩個(gè)圓環(huán),兩個(gè)圓環(huán)圍繞形成兩個(gè)獨(dú)立的寬45空腔,此空腔作為多肽底物折疊的空間。每個(gè)GroEL亞單元可以被分成3個(gè)不同的區(qū)域:(1)赤道結(jié)構(gòu)域(equatorialdomain),由第6～133和409～523氨基酸殘基構(gòu)成,它組成圓筒的中央部分且主要為α螺旋,具有調(diào)節(jié)所有中間接觸及大部分內(nèi)部接觸的作用。同時(shí)還含有面向中央腔的ATP結(jié)合位點(diǎn)。(2)頂端結(jié)構(gòu)域(apicalregion),由第191～376氨基酸殘基構(gòu)成,與赤道結(jié)構(gòu)域不同,其構(gòu)相變化不穩(wěn)定。它位于GroEL圓筒的開口處,且含有GroES和多肽底物的結(jié)合位點(diǎn)。多肽結(jié)合在由兩個(gè)面向中央空腔的單環(huán)形成的疏水槽內(nèi),這與早前使用定點(diǎn)突變分析所得結(jié)構(gòu)相吻合。(3)中間結(jié)構(gòu)域(intermediatedomain),也被稱為鉸鏈結(jié)構(gòu)域(hingedomain),由第134～190和第377～408氨基酸殘基構(gòu)成,其作為分子鏈連接頂端結(jié)構(gòu)域和赤道結(jié)構(gòu)域,作用是傳導(dǎo)兩結(jié)構(gòu)域間的變構(gòu)信號(hào),及建立核苷酸結(jié)合部與GroES/多肽結(jié)合部之間的緊密偶聯(lián)。輔助分子伴侶GroES是一個(gè)圓頂型的七聚體,直徑75,高30。它幾乎全部由β折疊構(gòu)成,Landry等發(fā)現(xiàn),天然的GroES有一個(gè)高度活動(dòng)及趨向性的多肽袢環(huán),袢環(huán)的活動(dòng)性及趨向性隨GroEL/GroES復(fù)合體的形成而消失。對(duì)合成肽的研究還發(fā)現(xiàn),袢環(huán)與GroEL上的一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)相結(jié)合,而此結(jié)合位點(diǎn)與底物結(jié)合位點(diǎn)是不同的。袢環(huán)的活動(dòng)性及趨向性,可能使得它的七個(gè)部分更容易與GroEL的七個(gè)亞基同時(shí)結(jié)合,這樣可使每部分采取不同的排列,借此變構(gòu)效應(yīng)來調(diào)整GroEL/底物的親和力。GroES與GroEL的頂端結(jié)構(gòu)域結(jié)合,且要求GroEL環(huán)上的氨基酸位點(diǎn)與ATP或ADP結(jié)合。GroES的袢環(huán)與GroEL的疏水肽溝槽結(jié)合并固定。2.1.2中間結(jié)構(gòu)域和底物的變化GroE可以促進(jìn)其它蛋白多肽的折疊,同時(shí),GroE在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)插入E.coli細(xì)胞質(zhì)膜過程中起重要作用。GroE是最早被研究,也是研究最詳細(xì)的伴侶因子,它已成為輔助蛋白折疊的模型。多年來,已有很多關(guān)于GroE結(jié)構(gòu)和功能的研究結(jié)果,使得我們可以更好地理解分子伴侶工作的基本原理。GroEL與GroES、ATP等組成一個(gè)協(xié)助蛋白折疊的系統(tǒng),其實(shí)質(zhì)是給非天然多肽(nonnativepolypeptide)提供一個(gè)隔離的工作平臺(tái),其工作過程是由ATP的結(jié)合與水解所驅(qū)動(dòng)的分子伴侶構(gòu)象變化的循環(huán),此循環(huán)分三個(gè)步驟:(1)GroEL攝取多肽底物;(2)隨著GroEL與GroES及ATP的結(jié)合,底物被置于一個(gè)可以促進(jìn)蛋白折疊的特殊微環(huán)境中;(3)隨著ATP的水解,多肽被重新釋放到溶液中。這三種功能狀態(tài)的轉(zhuǎn)變主要由ATP、GroES、底物與GroEL的結(jié)合而產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)。GroEL與底物的結(jié)合,主要是頂端結(jié)構(gòu)域與非天然構(gòu)象底物蛋白的疏水性結(jié)合,引起顯著的構(gòu)象改變,尤其是頂端結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的改變(環(huán)向上、向外旋轉(zhuǎn))使空腔直徑幾乎增大一倍,體積由原來的850003增大到1750003。隨后,GroEL中組成多肽結(jié)合位點(diǎn)的疏水殘基離開空腔表面,被空腔壁覆蓋,這時(shí)空腔內(nèi)部就成為一個(gè)親水表面。隨后,GroES阻斷空腔的出口,這時(shí),空腔便由疏水多肽的受體成為蛋白折疊的閉合微環(huán)境。最后,ATP的水解導(dǎo)致GroES的解離,使底物蛋白釋放出來。如果此底物蛋白并未達(dá)到天然構(gòu)象,它還可以進(jìn)人另一次循環(huán)。對(duì)分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),中間結(jié)構(gòu)域存在順式、反式兩種構(gòu)象,其構(gòu)象變化在與GroES的相互作用、結(jié)合ATP并將其水解以及對(duì)底物的折疊和解折疊中起到重要作用。GroEL是一類泛宿主性的伴侶因子,它可與許多底物蛋白相作用,據(jù)估算有300多種大小不一的蛋白多肽底物。其中多數(shù)參與重要物質(zhì)的代謝,包括氨基酸代謝(腺苷甲硫氨酸合成酶),糖代謝(磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶),嘌呤嘧啶生物合成等等。另外在轉(zhuǎn)錄、翻譯機(jī)器和酶的主要成分,如RNA聚合酶、核糖體蛋白、tRNA合成酶,等等,這些蛋白中大約有1/3結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,常需反復(fù)進(jìn)入GroEL,以維持其正確構(gòu)象。多肽與GroEL結(jié)合最初是基于疏水作用,這已由結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)分析證明,同時(shí)靜電的相互作用也可能起到一定的作用。與正確折疊的蛋白不同,未折疊或部分折疊的多肽常常會(huì)暴露其疏水表面,這些疏水表面會(huì)非特異的結(jié)合形成聚合物。所以蛋白多肽折疊不佳會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。無(wú)生理作用的蛋白質(zhì)大量聚集后,可以被溶酶體水解清除,但若過度聚集超出溶酶體的水解能力,可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。GroE在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)插入E.coli細(xì)胞質(zhì)膜過程中起重要作用。Phillips等的實(shí)驗(yàn)表明,在GroEL功能缺陷的E.coli菌株中,分泌蛋白的輸出受到損傷。根據(jù)熒光印跡結(jié)果分析,GroEL的膜靶蛋白是SecA,后者是轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中的一個(gè)中心蛋白,它與SecY形成蛋白質(zhì)傳導(dǎo)膜通道。GroEL與膜結(jié)合的SecA相互作用同某些生理活動(dòng)是相關(guān)的,如GroEL能與新合成的分泌蛋白或膜蛋白相互作用,促進(jìn)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)其插入細(xì)胞質(zhì)膜中。GroEL作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),可能是通過維持SecA在各種條件下的功能活性構(gòu)象來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然,SecA并不是GroEL識(shí)別的唯一膜成分,別的未鑒定出來的蛋白質(zhì)也可能與GroEL有作用。另外,在一些情況下,GroEL可以通過刺激SecA從膜中釋放,來調(diào)節(jié)SecA與膜結(jié)合的周期。2.2cct和trc通過實(shí)驗(yàn)整合引物來表達(dá)第二組伴侶因子存在于古細(xì)菌及真核生物的胞質(zhì)中,這類伴侶因子與第一組伴侶因子僅有很低的序列同源性,其結(jié)構(gòu)及組分有一定的異質(zhì)性。這類伴侶因子可能是由1～3種不同蛋白組成的八聚體或九聚體。其中最為復(fù)雜的就是真核生物胞質(zhì)內(nèi)伴侶因子,即前述的包含TCP-1的伴侶因子(CCT或TRiC)。最早發(fā)現(xiàn)此蛋白時(shí),它的序列與真核細(xì)胞的T-復(fù)合體多肽-1(t-complexpolypeptide1,TCP-1)十分相近,隨后TCP-1相關(guān)基因在真核細(xì)胞被發(fā)現(xiàn),且證明其有分子伴侶功能,故現(xiàn)今仍沿用CCT和TRiC。而古細(xì)菌中的伴侶因子被稱為溫度傳感器(Thermosome),是因?yàn)樗鼈冏钤绫话l(fā)現(xiàn)存在于嗜熱類生物。第二組伴侶因子的八圓環(huán)結(jié)構(gòu)與第一組伴侶因子GroEL的七圓環(huán)在形態(tài)上有明顯差異,同時(shí)二者功能上亦有差異。如上所述,GroEL是一類泛宿主性的伴侶因子,它可與許多底物蛋白相作用,而CCT具有一定的選擇性,且有對(duì)細(xì)胞支架蛋白的傾向性,如對(duì)肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的作用。除此以外,CCT的作用機(jī)制與GroEL不同,因?yàn)槠淙鄙傧馟roES一樣幫助伴侶因子腔內(nèi)折疊的輔助因子。下面以CCT為代表闡述第二組伴侶因子的結(jié)構(gòu)和功能。2.2.1cct為雙環(huán)復(fù)合體的一般形態(tài)伴侶因子分子較大,便于在電鏡下觀察,同時(shí)可以使用X-ray結(jié)晶成像術(shù)得到更加清晰的結(jié)構(gòu)分析。電鏡顯示,CCT是一種典型的單體不同的雙環(huán)復(fù)合體,復(fù)合體形狀如桶,且有圓頂狀的末端。CCT也是由兩個(gè)圓環(huán)背靠背組成,每個(gè)環(huán)由八個(gè)不同的同源亞基構(gòu)成(30%的同源性),亞基分別命名為CCTα,β,γ,δ,ε,ζ,η和θ亞基(酵母中稱為CCT1～8),亞基在環(huán)內(nèi)的排列是固定的。2.2.2其他分子中蛋白的缺失的功能早期的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,TCP-1與細(xì)胞骨架,尤其是微管系統(tǒng)有關(guān)。近幾年的研究證實(shí),包括TCP-1在內(nèi)的伴侶因子可輔助新合成的肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的折疊。Brown等在對(duì)中心體研究中證明Hsp73和TCP-1是中心體的組成成分,同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗TCP-1抗體阻斷微管從中心體的再生,并證明了TCP-1作為分子伴侶輔助微管蛋白的正確折疊與裝配。這種伴侶因子可以直接與細(xì)胞骨架蛋白如α、β、γ微管蛋白、肌動(dòng)蛋白及角蛋白接連,另外它還是中心體的組成部分,與微管的核化有關(guān),只有古細(xì)菌中的成員有應(yīng)激誘導(dǎo)性。3可能的隨機(jī)性因素的臨床意義3.1cpn60與胰腺疾病的關(guān)系Velez-Granell等發(fā)現(xiàn),伴侶因子60(Cpn60)及其輔助因子10(Cpn10)在胰腺腺泡細(xì)胞中的分布與胰酶的一致,而且沿胰酶合成分泌的途徑,即從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(roughendoplasmicreticulum,RER)、高爾基體(Golgi,G)到酶原顆粒(zymogengranule,ZG)(RER-G-ZG),濃度不斷上升,最終隨胰酶排入腺泡管。這種Cpn60與胰酶共分布的現(xiàn)象提示Cpn60在胰腺中參與了胰酶蛋白合成分泌的過程。這一假說后來得到了有力的證明,Bendayan等用蛋白金標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(proteinA-goldimmunocytochemistrytechnique)看到,沿胰酶合成分泌的途徑,Cpn60與胰腺的脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶在量上有明顯的相關(guān)性,且在分離的胰腺酶原顆粒中加入Cpn60抗體,上述消化酶與Cpn60同時(shí)被沉淀,表明Cpn60與其相伴行。由此聯(lián)想到Cpn60與一些胰酶異常的疾病,如急性胰腺炎AP、糖尿病等發(fā)生發(fā)展的可能的關(guān)系。急性胰腺炎可由不同原因引起,而每一因素通過不同的機(jī)制引起胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活,進(jìn)而損傷腺泡細(xì)胞及整個(gè)胰腺。已知胰腺蛋白酶過早激活引起胰腺自身消化性損傷是胰腺炎發(fā)生的一個(gè)重要事件,但其發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。Lee等使用水浸潤(rùn)應(yīng)激(water-immersionstress)大鼠,誘導(dǎo)其Cpn60高表達(dá),可以防止腺泡細(xì)胞內(nèi)的胰蛋白酶原的激活,從而減輕由雨蛙肽(caeruline)誘導(dǎo)的急性胰腺炎的嚴(yán)重程度。其他類似研究報(bào)道,熱、酸、滲透壓改變等應(yīng)激狀況,或休克等均可誘導(dǎo)Cpn60的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)增加,這被認(rèn)為是一種適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)(adaptivecytoprotection)。在胰管逆行注射膽鹽誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠模型,胰腺腺泡中的淀粉酶,胰蛋白酶,脂肪酶含量持續(xù)在高水平,作為適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù),Cpn60的含量應(yīng)該上升,但有實(shí)驗(yàn)看到,胰腺腺泡細(xì)胞中Cpn60水平反而降低,尤以酶原顆粒中的更為明顯,認(rèn)為與胰酶伴行的蛋白伴侶相對(duì)不足,可能引起胰酶堆積于腺泡細(xì)胞,促使其胞內(nèi)激活的發(fā)生。另外,急性胰腺炎時(shí)腺泡細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多、分布異常,加上胰脂肪酶以及蛋白酶含量增多,Cpn60含量減少,這些異常變化可能是胰酶胞內(nèi)激活的