雙菌種制曲在米曲霉和黑曲霉中的應用

柴油起源于中國。它是一種復雜且多種成分和功能的調食食品。它還具有三種味道：味道、營養和健康。醬油含有l8種氨基酸,其中包括人體所需的八種必需氨基酸,還含有對人體有重要作用的功能性物質,這些功能性物質具有抗氧化,防衰老等作用。醬油的生產主要分為兩個階段,前發酵和后發酵。前發酵主要是米曲霉的培養,促進可以產生酶類的孢子和菌絲的生長,這些酶類在后發酵階段實現原料中蛋白質和淀粉等物質的分解和轉化。米曲霉蛋白酶活性的高低對于提高原料的利用率,保證產品的品質和生產的低成本極為重要,并且在形成醬油獨特的色、香、味、體方面起著重要的作用。因此,菌種的好壞直接影響著醬油的產量和質量。釀造醬油多采用米曲霉制曲,米曲霉可以產生堿性、中性蛋白酶和一些淀粉酶類,但是缺乏酸性蛋白酶,其他物料分解酶如果膠酶、纖維素酶等活力也較低。在醬油發酵后期,醬醅pH值逐漸降低,偏離米曲霉分泌蛋白酶的最適pH,造成蛋白質利用率和氨基氮生成率低,缺少酯香等。雙菌種制曲添加了可以產生酸性蛋白酶的黑曲霉,當pH值降低時,酸性蛋白酶逐漸發揮作用,增加了蛋白質原料的分解,因此,與單菌制曲相比,多菌種制曲具有優越性。許多學者對多菌種制曲進行過相關研究,雖取得了一定的效果,但是難以應用于工業生產,主要原因是黑曲霉和米曲霉生長不同步,且黑曲霉對米曲霉的生長有一定的抑制作用。有研究表明,將米曲霉和黑曲霉分開制曲,發酵前再混合的方法可以有效提高原料利用率,但無疑會增加勞動強度、能源消耗和生產成本。因此,解決米曲霉和黑曲霉生長不同步的問題成為能否實現雙菌種制曲的關鍵所在。本研究采用本室研制的釀造激活劑加速米曲霉的萌發,為解決此問題提供了較好的辦法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒米曲霉(AspergillusOyzae)滬釀3.042;黑曲霉(Aspergillusniger)滬釀3.350。1.1.2蒸汽消毒器shngp生態吐溫80,青霉素,激活劑(實驗室配制),臺式顯微鏡,電熱恒溫水浴鍋,蒸汽消毒器(山東新華醫療器械廠),SHANGPINGFA1004電子天平。1.2方法1.2.1不同激活劑的豆漿按成曲物料比豆粕∶麩皮為6∶4的比例配制培養基,加10倍于物料的水,在55℃浸泡3h,在浸泡豆粕時加入一定比例的激活劑。浸泡后用濾紙過濾,取上清液121℃滅菌20min,為培養孢子時的液體培養基。1.2.2運行溫度對芽孢桿菌生長的影響取50mL三角瓶加入20mL滅菌生理鹽水,玻璃珠、磁力轉子,黑曲霉或米曲霉孢子以及適量青霉素,加入0.1%(V/V)的吐溫80,以使孢子分散均勻,振蕩3h,調節孢子懸液濃度,使其濃度在106～107個/mL,與液體培養基按1∶15(體積比)比例混合,取0.2mL于滅菌的載玻片上,至于滅菌的平皿中,分別在不同溫度下培養,顯微鏡下觀察孢子萌發情況。1.2.3蓮子萌發率在每個樣品中取中間部位三個視野進行計數,以保證培養條件的一致性,每個視野中孢子數目約為100個,分別記錄已萌發孢子數目和未萌發的孢子數目。種曲質量的好壞直接影響到醬油成品質量的優劣,為保證醬油質量,以孢子萌發率在85%以上為合格種曲指標。孢子萌發率=已萌發孢子數目已萌發孢子數目+未萌發孢子數目×100%。實驗所得數據均為三組數據的平均值。1.2.4最佳激活劑濃度的確定采用添加不同激活劑濃度的液體培養基,在32℃下培養米曲霉和黑曲霉孢子,計算孢子萌發率,比較得出最佳的激活劑濃度。1.2.5豆漿培養液體培養比較菌絲生長速度:測定孢子萌發率后,繼續以相同溫度培養至20h,比較孢子生成情況。豆粕培養比較菌絲生長狀況:取10g經初步篩選的豆粕,以保證豆粕大小相近。添加干物料重的0.3%,0.4%和0.5%的激活劑,與水混勻后浸泡豆粕,豆粕∶水為1∶1。121℃滅菌20min,接入0.1%的米曲霉,培養一定時間后比較菌絲生長情況。2結果與討論2.1培養6h的黑曲霉和米曲霉的抗菌力32℃米曲霉和黑曲霉孢子萌發率比較見圖1。由圖1可見,從開始萌發至6h時,黑曲霉的孢子萌發率均比米曲霉高。培養6h后,黑曲霉和米曲霉的孢子萌發率分別達69.3%和63.1%。培養6.5h后,米曲霉和黑曲霉的孢子萌發率均達到95%以上,超過合格種曲指標85%。此時黑曲霉的菌絲長度大于米曲霉的菌絲長度,說明黑曲霉孢子萌發快,菌絲生長速度快。由于米曲霉和黑曲霉孢子萌發不同步,雙菌種制曲時,最后成曲中只有黑曲霉成為優勢菌株,達不到預期的效果。2.23激活劑添加量對米曲霉分子發展的影響不同濃度激活劑對米曲霉孢子萌發率的影響見圖2。由圖2可見,添加激活劑后可以加快米曲霉孢子的萌發。圖1中,32℃培養6h米曲霉孢子的萌發率為63.1%,圖2顯示,添加0.3%,0.4%,0.5%濃度激活劑后,相同溫度下培養6h孢子萌發率分別為67.2%,74.6%和68.6%。32℃培養時,添加0.4%的激活劑孢子萌發最快,在培養過程中,米曲霉的孢子萌發率達一直最接近黑曲霉孢子的萌發率。培養6h后,雖然所有樣品的孢子萌發率均在95%以上,超過合格種曲指標85%,但菌絲發育程度有明顯差別,先萌發的孢子菌絲生長較好,菌絲較長較粗,意味著菌絲成熟產生孢子的時間可能提前,這就為縮短制曲提供了條件。2.3激活劑對米曲霉的芽孢萌發率影響38℃米曲霉和黑曲霉孢子萌發率見圖3。比較圖1,圖2,圖3,在32℃培養時,4.5h的孢子萌發率與38℃培養時4h的孢子萌發率相近,均為10%左右,由此可知與32℃相比,38℃時孢子提前萌發約0.5h。由圖2.3可知,添加0.4%的激活劑后,在38℃下培養4.5h,米曲霉的孢子萌發率達72%,黑曲霉的孢子萌發率為73%,二者基本一致。在培養5h后,二者的孢子萌發率均能達到95%以上,與在32℃培養時孢子萌發率達到95%所需時間6.5h相比,縮短了1.5h。由此可知,添加適量濃度激活劑以后,提高培養溫度,不但可以促進米曲霉孢子萌發,使之趕上黑曲霉,還可以縮短孢子萌發及菌絲生長成熟的時間。圖2中,添加0.4%激活劑的米曲霉孢子萌發率和不加激活劑的黑曲霉孢子,萌發率較為一致,圖3中添加0.4%激活劑的米曲霉孢子萌發率和添加激活劑的黑曲霉孢子萌發率較為一致。二者唯一的差別是培養溫度的不同。出現此種情況的原因可能是在38℃培養時,因溫度較高,對黑曲霉和米曲霉孢子萌發均有抑制作用,但因添加了具有激活作用的激活劑,使得加入激活劑后的黑曲霉和米曲霉的保證萌發率較為一致。2.4激活劑對酪氨酸生長速度的影響2.4.1激活劑對米曲霉的影響由圖4可見,培養20h后,菌絲體產生梯形或網狀的連接現象。與不加激活劑的米曲霉相比,加入激活劑的米曲霉在培養20h已經產生大量的孢子。加入激活劑可以使菌絲生長速度加快,盡早成熟,縮短制曲時間,進而縮短醬油的生產周期。2.4.2激活劑的用量對米曲霉菌絲生長的影響由圖5可知,米曲霉孢子在添加0.4%的激活劑的豆粕上培養5.5h后,米曲霉菌絲生長旺盛,菌絲較長。添加激活劑與不添加激活劑的相比,孢子萌發顯著。3激活劑的用量由于黑曲霉比米曲霉孢子萌發速度快,文獻報道的雙菌種制曲主要采用米曲霉和黑曲霉分開制曲,發酵時再混合的方法,既避免黑曲霉成為主要優勢菌,又能在發酵時彌補米曲霉酸性蛋白酶的不足,但勞動強度、能源消耗增加,使之難以應用于實際生產。添加0.4%的激活劑可以促進米曲霉孢子提前萌發,使得米曲霉與黑曲霉在38℃下培養4.5h的孢子萌發較為一致,為實現雙菌種制曲提供了理論依據。微生物在生長過程中需要一些特定的營養因子。本實驗室研制的激活劑中含有激活性營養因子,可以誘導孢子萌發,促進米曲霉和黑曲