原位pcr技術(shù)在核酸檢測中的應(yīng)用

20世紀(jì)70年代，原始酸分子雜交技術(shù)（ish）開發(fā)。通過堿基互補原則，標(biāo)記準(zhǔn)樣品可用于研究組織、細(xì)胞和組織中的準(zhǔn)分酸段的定位。為了改善細(xì)胞、細(xì)胞和染色體中核酸的定位，它具有精確的定位特征，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳等學(xué)科。1985年P(guān)CR技術(shù)的出現(xiàn)興起了分子生物學(xué)的熱潮,PCR通過聚合酶鏈反應(yīng)將目的核酸序列按指數(shù)倍擴增,成為獲得特異性核酸片段或放大基因信號的有效手段。HaaseAT等首次報道了原位PCR方法,檢測到了初期感染綿羊脈絡(luò)膜叢細(xì)胞的維斯納病毒RNA反轉(zhuǎn)錄出的少量DNA片段,這一方法將原位雜交的定位和PCR的敏感性結(jié)合起來,大大地提高了原位雜交對低復(fù)制樣品檢測的敏感性,克服了PCR技術(shù)因擴增產(chǎn)物無法在細(xì)胞組織中定位而不能與形態(tài)學(xué)特征結(jié)合的不足,成功定位檢測到細(xì)胞或組織樣品中的極少量甚至單個核酸序列。作為一種分子生物學(xué)技術(shù),原位PCR與傳統(tǒng)病理組織學(xué)方法密切結(jié)合,較好的將定性、定位以及相對定量技術(shù)聯(lián)系起來,將形態(tài)、代謝和功能的研究在分子水平統(tǒng)一起來,在病理學(xué)研究和病理學(xué)診斷中得到了迅速的發(fā)展。1pcr擴增產(chǎn)物的制備方法將細(xì)胞懸液或固定于涂片、載片、冰凍切片、石蠟切片上的組織細(xì)胞用消化酶處理,以獲得適當(dāng)?shù)哪ねㄍ感?使PCR反應(yīng)體系組分到達(dá)細(xì)胞內(nèi)目的核酸片段,通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增后,再使用核酸探針進(jìn)行雜交,觀察擴增產(chǎn)物與組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和病理變化的關(guān)系,主要方法有以下幾種。1.1標(biāo)記物pcr擴增將細(xì)胞懸液或切成小塊的載片放到常規(guī)PCR反應(yīng)的小管中,使用標(biāo)記的引物或核苷酸,使擴增產(chǎn)物直接攜帶可被檢測到的標(biāo)記物如放射性同位素或生物素、地高辛等,該方法操作簡便,但是擴增效率較低,且因組織內(nèi)受損DNA修復(fù)而易引起假陽性,應(yīng)用受到一定的限制。1.2酸廢料回復(fù)壓測定首先按照常規(guī)PCR的反應(yīng)體系利用不帶任何標(biāo)記的引物或核苷酸將目的核酸片段在原位PCR熱循環(huán)儀中擴增后,再使用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原位雜交進(jìn)行檢測。該方法雖然步驟復(fù)雜,但是擴增效率較高,特異性較強,是目前使用最多的原位PCR方法。1.3基于mrna的特異性pcr檢測該方法用于檢測細(xì)胞內(nèi)低復(fù)制的mRNA,首先使用DNaseI破壞組織中原有DNA后,利用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下,以mRNA為模板合成cDNA,再用間接原位PCR方法檢測特異性的cDNA。為了克服DNA消化不完全而產(chǎn)生的非特異性擴增,KherR等采用限制性酶對樣品進(jìn)行預(yù)處理,較好地消除了這種假陽性。此外,還有將PCR技術(shù)與熒光原位雜交(FISH)結(jié)合的引物介導(dǎo)原位標(biāo)記技術(shù)(PRINS)和檢測mRNA的原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)(3SR)等,都是與原位PCR相似的技術(shù)。2疾病本質(zhì)的變化病理學(xué)研究的目的是通過試驗來揭示疾病的原因以及發(fā)生發(fā)展規(guī)律,闡明機體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能代謝等方面的變化,對深入認(rèn)識疾病本質(zhì)有著重要的意義。原位PCR可以在分子水平上將組織形態(tài)與基因定位、基因表達(dá)水平較好地聯(lián)系起來,準(zhǔn)確區(qū)分正常與變異細(xì)胞、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞,為病理學(xué)研究提供了適宜的手段。2.1早期感染途徑和發(fā)病機制原位PCR由于具有極高的敏感性,可以在病毒侵入細(xì)胞后不久即可檢測到。黃廣明等利用原位反轉(zhuǎn)錄PCR方法研究了雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的早期侵染過程,在接種病毒4h后即在肝、脾、腎等組織中檢測到陽性細(xì)胞,顯著早于免疫組化和原位雜交等其他方法。姚英民等用原位PCR方法研究了輪狀病毒(RV)在腸道外的器官組織中的分布,證明了RV的組織泛嗜性,為闡述此類疾病感染途徑和發(fā)病機制提供了依據(jù)。研究病毒感染體外培養(yǎng)細(xì)胞中的定位也常用到原位PCR,邵軍軍等利用該技術(shù)觀察到口蹄疫病毒在BHK-21細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制和增殖。2.2白質(zhì)的檢測對于采用免疫組織化學(xué)難以檢測到的表達(dá)量較少的蛋白質(zhì),如表皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子等,可以通過原位PCR來檢測該蛋白質(zhì)的mRNA的表達(dá)水平,來研究蛋白質(zhì)的功能、代謝以及細(xì)胞定位等問題。2.3外源基因?qū)霗C體與受細(xì)胞的相互作用在轉(zhuǎn)基因動物、器官移植、基因治療等過程中,原位PCR技術(shù)可用于研究外源基因?qū)霗C體后與受體細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。YoshiokaT等將綠色熒光蛋白基因插入干細(xì)胞基因組,隨后采用原位PCR技術(shù)與熒光顯微鏡分析干細(xì)胞移植后在受體中的生長發(fā)育情況。3病理學(xué)診斷方法病理學(xué)是溝通基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的橋梁,病理學(xué)診斷方法屬于一級診斷。原位PCR技術(shù)由于具有高度敏感性的特點,在臨床病理學(xué)上也有一定的應(yīng)用。3.1原位pcr技術(shù)原位PCR技術(shù)常用于組織標(biāo)本上感染性病原體的檢測,特別是用于在艾滋病病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、圓環(huán)病毒等的潛伏期、早期感染、慢性感染和慢病毒診斷中,免疫學(xué)方法難以檢出的情況。在細(xì)菌檢測中,原位PCR常用于診斷結(jié)核桿菌與麻風(fēng)桿菌。原位PCR技術(shù)在診斷原蟲感染上也有較好的應(yīng)用,在弓形蟲的輕度感染中,原位PCR較好地克服了弓形蟲感染在病理組織形態(tài)學(xué)變化上和臨床癥狀上的非特異性,為公共衛(wèi)生控制提供了依據(jù)。原位PCR還可以通過對感染細(xì)胞比例的相對定量,判斷疾病的發(fā)展程度。3.2腫瘤發(fā)病影響因素分析臨床病理工作者已經(jīng)利用原位PCR技術(shù)檢測了人乳頭瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、禽紅細(xì)胞增生癥病毒(AEV)、禽白細(xì)胞增生癥病毒(ALV)等病毒癌基因與c-onc等細(xì)胞癌基因在多種器官系統(tǒng)腫瘤發(fā)生中的相關(guān)性,以及bcl-2等抗凋亡腫瘤相關(guān)基因等,通過對癌基因活化和抑癌基因失活的研究來分析腫瘤發(fā)病的因果關(guān)系。用原位PCR檢測免疫球蛋白的重鏈基因重排情況可以判斷B細(xì)胞的來源,診斷惡性B系淋巴細(xì)胞性腫瘤,鑒定霍金奇淋巴瘤H/R-S細(xì)胞的異質(zhì)性和同源性等,在腫瘤臨床診斷上有著重要的意義。3.3肌營養(yǎng)不良患者的間期細(xì)胞中抗肌渙縮基因缺失經(jīng)承學(xué)等利用原位PCR技術(shù)比較了正常人與杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良患者的間期細(xì)胞中抗肌萎縮蛋白基因的缺失,為此類無法醫(yī)治的遺傳性疾病建立可行的產(chǎn)前診斷方法,來預(yù)防和控制此類疾病的發(fā)生。4原位pcr技術(shù)的應(yīng)用前景原位PCR技術(shù)作為一門分子病理學(xué)技術(shù),其越來越廣泛的應(yīng)用為在分子水平上進(jìn)一步豐富病理學(xué)理論提供了方法,促進(jìn)了基礎(chǔ)病理學(xué)與臨床病理學(xué)的不斷發(fā)展。但是,目前的原位PCR方法還有操作復(fù)雜、假陽性、石蠟包埋標(biāo)本擴增效率低、無法精確定量等諸多問題,需要廣大病理工作者在實踐過程中不斷優(yōu)化試驗條件,完善和提高這一技術(shù)。原位PCR技術(shù)也應(yīng)當(dāng)積極與免疫組化、電鏡、體視學(xué)、組織芯片、流式細(xì)胞儀等技術(shù)結(jié)合,優(yōu)勢互補。原位PCR與免疫組化方法結(jié)合,可以同時利用抗原抗體結(jié)合的特異性和核酸堿基對結(jié)合的特異性對同一細(xì)胞內(nèi)DNA、mRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行研究;原位PCR與電鏡技術(shù)結(jié)合,可以觀察超微結(jié)構(gòu)變化,在亞細(xì)胞水平上研究特定核酸片段的分布規(guī)律;原位PCR與顯微分光光度法和病理圖像分析等體視學(xué)技術(shù)結(jié)合,可以提高相對定量的精確度;在組織芯片上使用原位PCR,可充分利用芯片高通量的特點,降低勞動強度,提高檢測效率;把流式細(xì)胞儀作為原位PCR的后續(xù)檢測分選工