植酸測定方法的比較

植物酸，也被稱為“六醇六磷酸”，由c6h184p6（ip6）代謝。廣泛分布于谷物、豆類、干果、蔬菜、水果中。這些食物中的含量高于大豆、谷物絲和玉米。植酸分子中具有能同金屬配合的24個氧原子、12個羥基和6個磷酸基,是一種少見的金屬多齒螯合劑。因此植酸可在食品工業、日化工業、醫學、紡織工業、金屬加工與防護業及其它工業中作食品添加劑、抗齲齒劑、發酵促進劑、防變色劑、抗氧劑、防腐劑、發酵促進劑、絡合劑等。同時植酸的抗營養特性和6個具有強解離質子的鄰位磷酸基團的強絡合特性,影響了單胃畜禽(豬、雞)等對飼料中蛋白質、鈣、磷、鋅、錳以及碳水化合物、脂肪的利用與吸收。而大量攝食小麥、大豆等植酸含量較高的谷物產品,被認為是發展中國家人群中普遍存在的鐵、鋅缺乏病癥的主要原因之一。因植酸的上述作用,就使得工業和科研中對植酸進行定性分析與定量檢測變得尤為重要。1定性分析和定量檢測植酸的提取和分離主要是將植酸從待檢樣品中提取并使之與樣品中其他成分分離,為進一步進行定性分析或定量檢測奠定基礎。植酸的提取原理是利用其可溶于稀酸溶液的特性進行的。目前提取用的稀酸主要是鹽酸(HCl)和三氯乙酸(TCA)。1.1離心藥品提取稱取過篩樣品加入1.2%HCl·10%Na2SO4溶液于室溫下攪拌浸提2h,4000r/min離心30min,取上清液于4℃冰箱中備用。用此種提取方法不但耗時,每個樣品僅提取就需要2h,而且對提取藥品的用量也非常大,每個樣品至少要提取液40mL。但優點是不需要借助儀器設備,只要三角瓶就可進行,操作簡單易行。1.2粗提植酸溶液的制備稱取粉碎后過篩樣品放入圓柱形濾紙筒中,濾紙直徑小于索氏提取器的內徑,其下端用細繩扎緊,其高度不得高于索氏提取器外側的虹吸管,加入一定量的浸提液于圓底燒瓶中,連接索氏提取器,提取一定時間后轉入蒸餾裝置回收粗提植酸樣品。此種方法耗時一般為3h,且藥品用量一般為100mL以上,同樣是費時費力,但提取率可達50%以上,且通過蒸餾裝置可以回收提取液。1.3超聲提取法稱取粉碎后過篩樣品加入浸提液至設定容量,后置超聲波細胞破碎器探頭于燒杯中深約3cm,設定功率、時間,進行超聲波處理。處理結束后,高速離心(8000r/min)20min,倒出上清液。采用超聲探頭振蕩提取,大大縮短了提取的時間,由傳統的浸提2~3h縮短為1~3min,也使植酸的大量檢測成為可能。但可能因超聲波法振蕩提取的時間較短,提取液混合不夠充分,導致其提取率只有45%左右,提取效率沒有索氏提取法高。1.4ase快速萃取萃取液這種技術的原理是將樣品溶液在加溫(50~200℃)、加壓(1500~2000Pa)的條件下用ASE快速萃取液進行快速萃取。加速溶劑萃取(ASE萃取)與傳統萃取相比具有耗時短,溶劑用量少等優點。但由于其設備昂貴,并不能普遍應用。2除雜劑的制備植酸的純化主要是去除粗提液中的雜質,通常可用離心、冷凍、解凍、沉淀法、交換柱分離、蒸發等方法去除。這些方法的主要目的是沉淀分離植酸類物質,沉降或者置換凝膠物質、可溶性蛋白質及無機磷,濃縮肌醇磷酸酯。2.1離子交換樹脂法測定植酸含量離子交換樹脂法純化植酸是根據植酸易溶于稀酸的特性,用稀酸將植酸從制備好的樣品中提取出來,經過離心和離子交換樹脂使植酸與雜質分離。此法首先要選擇適當的樹脂,可以是硅膠陰離子交換劑SAX、季銨型聚苯乙烯(氯型)樹脂、陰離子交換樹脂AG1-X8或201×8型強堿性陰離子交換樹脂。離子交換樹脂法測定樣品中植酸含量的原理是樣品提取液中植酸及其前體(從一磷酸肌醇到五磷酸肌醇)都可被陰離子樹脂吸附,并可被一定濃度的NaCl溶液洗脫,然后通過測定洗脫液中無機磷來測定植酸含量。樹脂需經過低濃度食鹽浸泡后上柱,再用水洗至無鹽狀態,備用。一般用國外樹脂的提取效果要好,但價格昂貴。國產的像季銨型聚苯乙烯(氯型)樹脂和201×8型強堿性陰離子樹脂(氯型)現在也取得了較好的結果,回收率較高,重現性較好。陰離子樹脂法測定樣品中植酸的缺點是費時、操作較繁鎖。不同濃度的溶液洗脫會有多次循環,同時如果樹脂太細時,洗脫需加壓,并要控制洗脫速度。2.2蒸發+洗脫液經過離子交換樹脂法純化后可以有效地濃縮肌醇磷酸酯、去除無機磷及大部分雜質。通過蒸發去除提取液和洗脫液中的HCl,否則,大量氫離子和氯離子的存在會干擾定量檢測結果。由以上兩步的分離純化后,就可以將植酸提取液進行直接的定量分析。3植酸及排酸分子的確定1872年Preffer首次發現植酸,1912年Anderson確定其分子結構,1914年Henhuer和Stadler首次建立了植酸分析的鐵沉淀法。至今測定植酸的方法已經衍生出了多種,但不同的測定方法有其適用性,且測定方法的不同會導致不同的回收率。3.1不同植物條件下植物酸的適用性3.1.1植物酸間接測定的適用性(1)無機磷突變體的篩選由于植酸含量的下降一般都伴隨著無機磷含量的升高,而總磷含量維持不變,因此由無機磷的含量就可以間接地反映出樣品中的植酸含量。王雪艷等用本方法來對玉米低植酸突變體進行篩選,通過篩選高無機磷(HIP)突變體來獲得低植酸突變體。因此,在進行低植酸作物突變體的篩選工作時,可采用間接測定法進行。(2)標準曲線和方法檢出限呂杰等運用該法可以測定植酸的線性范圍為0~20μg/mL,相關系數為0.9996,植酸檢出限為0.144μg/mL,相對標準偏差為1.1%~6.6%。該法與消化測磷法的測定結果比較,差異無顯著性。該法操作簡便快速,結果準確可靠,便于推廣應用。(3)實際耗用硫代硫酸鈉摩爾數法其原理為植酸與硫酸銅反應生成植酸銅沉淀。多余的硫酸銅與碘化鉀反應析出游離碘,用硫代硫酸鈉標準溶液滴定,根據耗用硫代硫酸鈉的摩爾數,計算出實際耗用的硫酸銅溶液的摩爾數,然后計算出試樣中的植酸含量。用硫酸銅—碘量法操作簡便、重復性好、準確性較高。3.1.2植酸含量檢測方法(1)用雙吡啶直接定量測定樣品中植酸含量。由樣品與雙吡啶巰基乙酸反應在519nm條件下吸光度值換算出植酸的含量。此方法植酸鈉含量在600μg以內呈線性關系。(2)比色法依據是通過植酸與三價鐵的定量反應,以及過量鐵與磺基水楊酸的顯色反應來測定植酸含量的。分步顯色法其分析一個樣品所需時間不到30min,工作效率比沉淀消化法提高了十幾倍。比色法測定植酸由于所用時間大為節省,所用儀器比較簡單且常見,分析結果與HPLC基本一致,故此法是目前測定植酸含量的常用分析方法。(3)高效液相色譜(HPLC)測定植酸是由植酸樣品溶液通過0.45μm醋酸纖維膜過濾,用10μL微量注射器吸取一定量濾液,直接注入高效液相色譜儀測定。于254nm波長處測出植酸色譜峰的面積,由植酸標準曲線查出植酸含量。采用HPLC法可以將樣品中IP6及其部分降解產物(IP3~IP5)分離并定量測量。HPLC法一般是科研上用來對植酸產品進行準確測定時所用的方法。(4)近紅外反射光譜法(NIRS)。原理是在樣品具有相當厚度的情況下,用近紅外光照射,樣品透射光可忽略不計,入射光主要被樣品吸收或被樣品反射,樣品在近紅外區不同波長處便會產生相應的光密度值,其大小與樣品中植酸磷含量相關。NIRS在測定樣品前只需對樣品進行粉碎處理,應用相應定標軟件,便可測定成批樣品的植酸磷含量。1990年Parrish等人首次用近紅外反射法測定了棉花籽粒中的植酸。由于此法具有快速簡便、相對準確的優點,且不需化學試劑,分析樣品不損失,因此它將成為快速實施檢測的先導技術。(5)毛細管等速電泳法(CITP)。Blatny等運用CITP及傳導性檢測的方法觀察植酸水解產物與時間的關系,發現采用兩種不同的緩沖系時,ITP是一種快速、簡便的定量檢測IP~IP6及正磷酸鹽的方法。(6)31P-核磁共振(NMR)法可用來檢測IP6及其降解產物,并可同時確定磷酸根的位置。31P-NMR法在檢測植物組織中的IP6及其立體形狀,與其他成分如Cu2+,Zn2+等離子的連接狀態時非常適用。這種方法有一定的準確性及特異性,但設備昂貴,而且靈敏度較低,因此不能用來檢測低濃度的肌醇磷酸酯。3.2氯化鐵—不同測定方法的回收率武雪芬等利用植酸對磺基水楊酸鐵的脫色作用比色法測定植酸的回收率,當待測植酸濃度為0.1515×10-3~0.1515×10-5mol/L(即0.1‰~0.001‰),該法平均回收率為100.67%。廖明星等利用離子交換樹脂提取植酸,加入三氯化鐵—磺基水楊酸顯色法測定植酸,兩次的加標回收率達98%以上,測定的重復性<5%。褚西寧等用雙吡啶直接定量測定樣品中植酸含量,添加三種不同量植酸鈉內標的平均回收率為95%左右。蔣建軍用釩鉬黃比色法測定植酸含量的內標回收率在98%~104%之間。4問題和視角4.1提取-純化法雖然現在對植酸的測定方法有很多種,但還是沒有統一的檢測標準。沉淀法雖然操作簡單,而且儀器要求不高,但一是對滴定終點不好掌握,需要操作者有極為豐富的經驗,二是實際操作中發現這對樣品中植酸含量有很大的限制性,當植酸含量過高會因為褪色太明顯影響比色的結果或者分光光度計無法顯示,而植酸含量過低的話則會因為提取和純化時會損失很大,影響最終的結果。離子交換法對使用樹脂的要求較高,且洗脫的過程要經過幾次,操作繁瑣。特別是提取液中的氯離子對測定的結果干擾很大,但回收率和結果較理想。高效液相色譜法操作簡便,它將植酸的提純與測定同時進行,準確度及靈敏度高,但設備及標準物價格昂貴。近紅外反射光譜法、31P-核磁共振(NMR)法等都是設備極為昂貴,目前都無法推廣應用。毛細管等速電泳法的靈敏度相對較低,還需改進濃縮技術。4.2近紅外反射光譜法植酸檢測方法今后將會分為更具體,針對不同的研究目的采用不同的快速有效的檢測方法。用高效液相色譜法和近紅外反射光譜法是最為可靠的兩種方法。當對植酸的分子結構進行定性分析時用高效液相色譜法最為有效,它將提純與測定同步進行,為大量樣品的檢測提供了保證。而近紅外反射光譜法整個過程中不用浪費化學