固態發酵制備蛋白飼料的研究進展

隨著世界人口的增加和人民生活水平的提高，人們對優質高粱食物的需求增加，刺激了畜牧業的發展。然而，在水產養殖的發展過程中，人們對飼料行業的依賴與日俱增。據統計，我國蛋白飼料的供應不足，主要通過進口解決。預計我國蛋白飼料的出口可達2900萬噸。因此，我們迫切需要增加蛋白素的產量，緩解中國蛋白素的緊張局面。飼料業是連接種植業和養殖業的紐帶,是該產業鏈的核心,而種植業在加工產品的過程中,往往會產生大量的農林廢棄物,如玉米稈、甘蔗渣、蘋果渣等,這些廢棄物往往是直接扔掉,喂食動物或者直接燃燒作為能源,不僅造成環境污染,而且是資源的極大浪費。全世界因加工農業原材料生產食品而產生工農業廢棄物的量是巨大的,據統計我國每年產生的農林廢棄物達15億噸,這些被丟棄的廢棄物反過來又會增加環境的生化需氧量(BOD)負擔。來自加工蔗糖、橘子,咖啡,稻谷等農林廢棄物,原本通過微生物作用可以轉化成一些精細化學品如生物酶類等,此應用可顯著提高原料的經濟附加值被視為廢棄物。其實這些廢棄物中含有許多動物所需的重要營養物質如淀粉、脂類、蛋白質等,可以直接作為動物飼料的主體部分,但是由于這些物質中往往含有一些抗營養因子如單寧、棉酚、植酸和草酸等存在而導致動物對營養物質的消化吸收出現問題。此問題實際上可通過固態發酵可以使受到抗營養因子干擾或這些未被利用的營養物質經過動物喂養得到充分的利用,同時還可以在合適的條件下顯著提高蛋白質的含量。利用固態發酵技術對農林廢棄物進行營養轉化、富集及脫毒處理,生產為動物養殖業提供高蛋白生物飼料來源,不僅促進我過畜牧業發展,緩解我國飼料蛋白的緊張局面,而且對環境保護起著重要影響。本文作者主要從固態發酵的優缺點和影響發酵工藝的主要因素包括固態發酵基質的類別、菌種的選擇及固態發酵過程中工藝參數的影響進行闡述,并對固態發酵生產蛋白飼料過程中存在的問題及關鍵技術進行了展望,以期為固態發酵制備生物飼料工業化提供數據與理論的借鑒。1ssf技術特點固態發酵(solidstatefermentation,SSF)是指在培養基呈固態,雖然含水豐富,但沒有或幾乎沒有自由流動水的狀態下進行的一種或多種微生物發酵過程,底物(基質)是不溶于水的物質,它不僅可以提供微生物所需碳源、氮源、無機鹽、水及其它營養物,還是微生物生長的場所。固態發酵可以通過微生物作用將農林廢棄物中蛋白含量低或不利于動物消化吸收的物質轉化為營養價值、利用率高的動物飼料。與常規的液體深層發酵相比,SSF的優缺點包括:1)對發酵的底物水分含量要求不高,從而降低了細菌和真菌的污染;2)提供更高的通氣量,更利于有氧固態發酵的效率;3)提供真菌天然相似的場所,更利于真菌生長發酵;4)固態發酵的基質一般為農林廢棄物,基本能滿足微生物的生長,因此,培養基要求低,且是利于資源有效利用和環境保護的途徑之一;5)SSF反應裝置簡單,空間需求小;6)固態發酵通常伴隨著低能耗,因為工業級固態發酵如高溫高壓滅菌或者蒸汽預處理,機械攪拌和通氣等處理在一些固態發酵過程中往往是不必要的;7)“三廢”的排放量通常很小,因為產品濃度高且對于產品的萃取只需很少的溶劑;8)低濕度的特征可能會產生液態發酵過程中不能獲得或產量很小的一些特殊產物;9)有一些SSF的終產物更易于處理,如農林廢棄物的發酵蛋白飼料可直接進行烘干。當然,SSF技術也存在一些不足:1)樣品經常需要預處理如粉碎、物理、化學或酶水解處理、蒸煮或蒸汽處理;2)在固態發酵過程中如涉及到細菌發酵,往往要求濕度高,而恰與真菌低濕度要求相沖突,具體的發酵情況需要具體分析,一般情況下都是選擇高效率的低濕度真菌固態發酵;3)生物量比較難以確定;4)SSF過程中工藝參數如pH值、基質濕度、氧和生物質濃度難以精確控制;5)SSF往往都是靜態發酵(動態發酵難以控制),導致菌種與基質接觸不充分;6)SSF技術由于缺乏放大過程的設計和操作的一些重要信息,使一些應用于工業的固態發酵反應裝置還不成熟;7)容易導致一些真菌的污染;8)通氣可能會由于SSF的高濃度黏性固體基質而變得困難;9)SSF技術發酵時間長且發酵過程產生的余熱可能對微生物的發酵不利。2抗營養因子固態發酵過程對發酵基質無特殊要求,一般都富含淀粉、蛋白質、纖維素、礦物質等能直接或間接滿足微生物生長的一些必需營養物質,但也含有許多不利于動物消化吸收的抗營養因子,如植酸、單寧等。據文獻報道,研究固態發酵蛋白飼料的基質主要有棉籽餅、蘋果渣、豆粕渣、馬鈴薯渣、芒果渣、米糠等農林廢棄的糟渣或下腳料,實際上這些廢棄物都可以利用微生物的發酵作用,不僅提高蛋白質含量,也能降低這些物質中的抗營養物質,從而提高農林廢棄物的附加值。2.1底物顆粒越小,比微生物提高發酵效率。根據對于底物顆粒的影響,確定發酵過程對發酵基質往往需要考慮主要化學成分含量及物理形態如底物顆粒大小、孔隙率等,這其中底物顆粒形狀大小是首先需要考慮的,底物顆粒越小,增加了微生物與底物的接觸面積,提高了發酵效率;然而,并非發酵基質的顆粒越小越好,當基質的顆粒越小,底物的比表面積增大,同時也增加了它們之間的吸附力,容易產生抱團,凝結在一塊,反而不利于微生物的有效利用,同時也增加了傳質傳熱的阻力,因此,如想提高固態發酵的效率,則需要選擇恰當的原料顆粒大小。2.2抗營養因子應用于固態發酵的原料基本上都來自農林廢棄物,而這些原料通常含有普遍抗營養因子如植酸、單寧、棉籽酚、草酸、消化酶抑制劑、綠原酸等,這些化合物在不同程度上會影響到動物對飼料的消化吸收。為進一步說明動物抗營養物質的害處,敘述如下。2.2.1存在的形式植酸是植物中普遍存在,尤其在豆類和含油的種子如黃豆、油菜籽和棉籽中。62%~73%谷類的總磷以有機植酸磷形式存在,豆科種子內總磷的46%~73%以有機植酸磷的形式存在。除此之外,植酸具有很強的螯合性,同時也會螯合鈣、鎂和鋅等必需礦質元素及蛋白質。對于單胃動物喂食這類含植酸的物質會因其體內缺乏相關植酸酶而不能吸收利用,易導致磷和其他礦質元素的缺乏,從而使蛋白質和相關礦質元素的生物效價降低,不利于動物的健康成長。因此,對于上述問題一般通過向動物糧食飼料直接加入少量植酸酶以釋放動物所需的必需礦質元素和營養物質,或通過微生物如黑曲霉或枯草芽孢桿菌等對糧食飼料進行固態發酵產生植酸酶,來解決礦質元素及蛋白質生物效價低的問題。2.2.2溫度對粗飼料蛋白質利用率的影響單寧是一類分子量超過500的可溶于水的酚類物質,能在水溶液中與蛋白質結合產生沉淀而使蛋白質的利用率降低,它同時會干擾動物消化系統中的一些消化酶、維生素B12和鐵元素的吸收。單寧雖然可以通過高溫降解,但同時也會破壞粗飼料中的營養物質。通過一些產單寧酸酶的微生物如黑曲霉和檸檬酸桿菌、青霉菌等固態發酵能有效解決這一問題。2.2.3復合菌種乳酸菌、枯草芽孢桿菌棉籽酚主要存在于棉籽中含量約0.4%~2.4%,對動物的生長、發育及繁殖產生不利影響,用棉籽喂養動物時需將其除去,通過復合菌種(乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌)固態發酵可顯著降低棉籽中棉籽酚的含量。2.2.4礦質元素的吸持與植酸類似,具有很強的螯合作用,易影響鈣和鎂代謝,形成草酸鈣和鎂不溶性鹽,影響動物對鈣和鎂等礦質元素的吸收利用,草酸也能與蛋白質形成復合物,對單胃動物的消化產生不良影響。如生產過程中存在這種問題,可以考慮加入一種稱為盾殼霉(Coniothyriumminitans)的真菌,進而有效降解基質中的草酸,并且能抑制有害菌如核盤菌的生長,從而提高發酵效率。2.2.5對雞消化酶的影響蛋白酶抑制劑如綠原酸,在向日葵餅中含量較高,一種類似單寧作用的物質能影響動物消化系統中的的胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。然而在廣泛的微生物種類中存在著能降解綠原酸的微生物如芽孢菌(Bacillussp.Xy),它可以顯著降低綠原酸的含量。因此,可以考慮選擇此類芽孢菌以解決含有綠原酸發酵底物的問題。3菌種發酵對固體發酵蛋白飼料的影響固態發酵蛋白飼料的菌種包括細菌(枯草桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、乳酸球菌、芽孢桿菌等)、霉菌(曲霉、木霉、根霉等)和酵母菌(熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、釀酒酵母等),如表1所示。以固態發酵技術選擇單菌種為例,單菌種的選擇通常是以產高活力纖維素酶的黑曲霉作為應用最廣泛的發酵菌種之一,因固態發酵的底物通常都含有大量的纖維素。而酵母菌以產朊假絲酵母和釀酒酵母使用較為廣泛,其原因包括自身具有含量很高的蛋白質,同時又易于與其他菌種協同發酵。至于細菌,以植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌應用較為普遍,因其次級代謝產物(乳桿菌素和枯草菌素等)具有明顯抑制固態發酵過程的有害微生物作用而利于固態發酵蛋白飼料的品質提升。實際上,由于多菌種發酵有利于各菌種協同作用于固態基質,往往比單獨菌種作用效果更明顯,使之成為當前應用前景廣闊且研究的熱點。例如以黑曲霉與產朊假絲酵母混菌固態發酵水生植物提高產物蛋白質含量為例,實驗結果顯示,黑曲霉與產朊假絲酵母(1∶1,v/v)混菌發酵蛋白質產率,較其中單一菌種得到明顯提高,其原因就是黑曲霉先分泌纖維素酶降解基質中的纖維素轉化成寡糖和單糖,而產朊假絲酵母可以進一步將基質轉換的糖類作為碳源而進一步生長代謝發酵,從而進一步提高了固態發酵效率。因此,如今選擇的菌株已趨向于多菌種混合發酵,霉菌、酵母菌的組合發酵多見報道,這是由于霉菌分解淀粉、纖維素的能力強,可降解飼料中的結構性碳水化合物。將淀粉和纖維素降解為酵母能利用的單糖、雙糖等簡單糖類物質,使酵母得以良好地生長繁殖,從而提高產品的蛋白質含量和營養功能。這樣既減輕了產物抑制效應,又促進了酵母的生長。提高了發酵效率。常用的固態發酵菌種包括細菌、酵母菌和真菌,它們可以在廢渣的固態基質里良好生長,因此可以廣泛應用于固態發酵過程。細菌主要涉及到堆肥,青貯發酵及一些食品加工過程。酵母菌可以用來生產乙醇,食品和飼料。然而,絲狀真菌是一類最重要的應用于固態發酵過程的菌種,由于它們的生理,酶學和生化特性,由于真菌菌絲的生長方式的特點和良好的耐固態基質中的低水分活度和高滲透壓環境,使其在天然微生物種類中,生物轉化固態基質是非常有效和極具競爭力的。通過真菌發酵可以獲得更好的營養價值的產品,如降解粗大豆中抗營養的化合物(植酸、凝血素等)。絲狀真菌獨特的菌絲生長模式可以不斷從低端向上延伸并產生新的菌絲,并且能滲入到固態基質中。細胞壁粘結著頂端和菌絲分支確保它的穩固結構。菌絲頂端會分泌水解酶且不會大量稀釋,不會像液態發酵分泌的酶將大量稀釋,水解酶作用更強且滲入到大多數的固態基質中而發揮作用。因此,絲狀真菌往往是固態發酵的最佳適宜菌種之一,并且也是固態發酵研究的熱點菌種之一。4固體發酵工藝參數對于固態發酵過程是否能夠獲得成功,除了選擇良好的發酵基質和菌種外,對其發酵過程中工藝參數的控制顯得尤為重要。因為不同微生物都有其自己最適宜的生長環境,而固態發酵過程正是通過微生物利用基質中的營養物質使其能高效生長,同時能轉化為某些高營養物質如蛋白質或降解某些不利于動物消化吸收的物質如纖維素和單寧等。因此,有效控制微生物在固態基質的生長代謝,就能有效控制固態發酵過程,達到既定的目標。常用細菌、酵母菌和霉菌以及它們之間混合菌固態發酵工藝參數見表1。由表1可知,所用的發酵基質基本都來自農林加工廢棄物,細菌、酵母菌和霉菌是固態發酵常用菌種,但霉菌及酵母菌應用更廣泛。發酵菌種對濕度一般要求在50%~95%,濕度較低會導致發酵時間的延長和效率低。通常菌種的接種量也有所差異,一般情況下,細菌1%~5%,酵母菌5%~10%,霉菌7%~15%。發酵菌種的接種量通常取10%比較合適。發酵的溫度一般在25~30℃,發酵時間有2~5d較佳,一般pH值通常在7左右。在恰當的固態發酵條件下,對固態基質發酵前后蛋白含量提高的幅度最高可達約4倍。現對固態發酵工藝參數的影響敘述如下。4.1發酵過程濕度控制固態發酵基質含水量與水分活度有關,維持微生物發酵過程需要一定量的水分,是整個固態發酵過程成敗的關鍵,因為它直接影響到微生物的生長,還影響到基質物料的物理狀態,營養物質的擴散、吸收等,也會對傳質傳熱產生一定影響。濕度過高使基質通透性降低,阻礙氧氣的滲入,而濕度過低可能導致傳質不充分,從而影響微生物生長代謝所需營養的攝取。對發酵過程水量的控制應該基于發酵基質物料本身含水量以及微生物發酵過程的需求。發酵過程往往是微生物代謝旺盛,消耗一部分水的同時,產生的熱也會使水量減少,因此,需要在發酵過程中注意對水分的補充,可以通過增加微生物發酵環境濕度,如超聲霧化無菌水。4.2溫度對固體發酵過程的影響固態發酵過程由微生物代謝而產生大量的熱,容易影響微生物發酵過程,因此,對溫度的控制也是固態發酵過程很重要的一個方面。可以通過薄層發酵或培養,底部通風等保持一定的溫度。4.3檢測及控制固態發酵由于幾乎不含有自由流動的水,pH值難以檢測及控制。一般考基質良好的緩沖力進行自然控制,基質發酵加入一些酸堿緩沖液維持發酵過程的pH值相對穩定,使固態發酵過程能夠有效持續進行。4.4氧化碳的濃度固態發酵所使用的菌種大部分是好氧型的,通氣量多少主要是由菌種的特性、合成產物時的需氧程度、基質厚度、二氧化碳生成量等。二氧化碳及其他氣體的濃度對發酵或培養的影響很大,二氧化碳濃度過高會抑制微生物的代謝,進而影響目標產物的生成。由于現成的曝氣技術控制還不完善,現如今研究的主要方面是通過自然曝氣控制,因此,通氣量沒列在表1中,代表是自然條件通氣。4.5發酵罐內菌落的繁殖接種量的大小決定于生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度,采用較大的接種量可以縮短發酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間,使產物的形成提前到來,并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或過小,均會影響發酵。過大會引起溶氧不足,影響產物合成,而且會過多移入代謝廢物,也不經濟,過小會延長培養時間,降低發酵罐的生產率。4.6發酵時間與液體發酵相比,固態發酵的時間一般都相對較長,少則2~3d,多則1~2w。5固體發酵生物反應器設計生產發酵蛋白飼料大多是從農林廢棄物經微生物轉化而來,微生物在這一過程中扮演著非常重要的角色,對菌種的發酵效力要求很高。因為通過固態發酵生產的飼料蛋白主要包含3部分,分別是基質本身含有的蛋白質,微生物將基質中碳或氮源等轉化的蛋白質及微生物自身含有的蛋白質。菌種對發酵效率起著非常重要的作用,需要對發酵菌種進行篩選。可以通過自然環境篩選,人工誘變篩選或基因工程技術對菌種改造,達到獲得高效力的發酵菌種。此外,在固態發酵過程中,尤其是放大實驗,往往伴隨著大量熱的產生,會影響微生物生長代謝,進而影響發酵蛋白飼料的質量,這是固態發酵技術實現產業化的主要瓶頸。因此,如何控制固態發酵過程產生的熱量聚集而使體系過熱是生產發酵蛋白飼料產業化需要解決的關鍵技術。解決這一問題,可以通過對固態發酵生物反應器進行有效降溫設計來解決,有效控制發酵過程產生的熱量。固態發酵反應器的設計主要包括托盤式、填充床、流化床和臥式滾筒等,但截止目前,所設計的固態發酵生物反應器都沒能有效解決發酵過程的散熱問題。當然,所設計的發酵反應器需保證使基質層間傳熱傳質充分,在沒有損壞微生物和基質床顆粒前提下,菌種與基質需充分接觸混合,還要求能在線監測一些關鍵參數如pH值及濕度等,而這些要求都是至今難以解決的問題,更何況實現固態發酵技術的產業化。通過模擬固態發酵過程,模擬微生物生長代謝過程及熱量的變化,便于有效設計固態發酵生物反應器,從而解決發酵過程熱量釋放的問題。過去幾年固態發酵蛋白飼料技術有了顯著的發展,所涉及的方面包括動力學、數學模擬,生物反應器設計和固態發酵過程高級控制系統。對固態發酵技術模擬的研究是對放