體外經(jīng)細胞因子擴增并回輸前后惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞的變化

自然損傷細胞（nk）是存在于人體的免疫細胞。在過去，由于技術(shù)原因，nk細胞的外部擴張很難達到臨床治療的數(shù)量。擴散混合淋巴結(jié)的nk樣本（表面標記為cd16）20%的細胞只有10%20%。筆者采用改良的培養(yǎng)技術(shù),一次擴增可以達30~50億個混合淋巴細胞,主要含有CD4+、[作者簡介焦順昌,男,1984年第一軍醫(yī)大學(xué)畢業(yè),協(xié)和醫(yī)科大學(xué)1995級博士。電話:(010)66939761;E-mail:jiaosc@CD8+、CD16+、CD56+等細胞,其中帶有NK樣細胞標志的CD16+/CD56+細胞占20%~70%,可滿足臨床治療的需要。但回輸人體后對機體免疫功能有何影響?本研究試圖回答這一問題。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及術(shù)后輔助治療情況2007年3月-2008年6月于我院診治的惡性實體瘤患者,選取資料完整的共22例。其中非小細胞肺癌8例、大腸癌3例、胰腺癌5例、余為卵巢癌、胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤等;術(shù)后輔助治療后8例,晚期患者14例。男17例,女5例;平均年齡為54.14±12.96歲(31~77歲)。1.2輸注后細胞毒性檢測1.2.1淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)患者簽署知情同意書后,采抗凝血約40mL,在GMP層流實驗室進行擴增培養(yǎng),見張國慶等采用方法。1.2.2回輸方法培養(yǎng)好的混合淋巴細胞經(jīng)質(zhì)量控制合格后混懸于100mL生理鹽水中,用帶有濾膜的輸液器緩慢靜滴約1h,回輸前可肌注苯海拉明20~40mg。回輸前后及回輸過程仔細監(jiān)測生命體征及毒副反應(yīng)。每次回輸前抽靜脈血做外周血淋巴細胞亞群檢測。1.2.3淋巴細胞表型檢測外周血淋巴細胞及體外擴增后淋巴細胞應(yīng)用流式細胞術(shù)測定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56-、CD3+CD16+CD56+細胞在淋巴細胞中所占百分比的情況。1.2.4統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS10.0軟件進行分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示(xˉ±s)表示。2結(jié)果2.1細胞培養(yǎng)成熟時所得淋巴細胞的計數(shù)及增殖個數(shù)外周血淋巴細胞擴增培養(yǎng)平均時間為13.46±1.20d;細胞培養(yǎng)成熟時所得淋巴細胞數(shù)為(2.99±0.65)×109,擴增倍數(shù)為488.06±191.25;苔盼蘭染色檢測細胞存活率為97.71%±1.07%。2.2返回后的副反應(yīng)分析22例患者經(jīng)細胞回輸治療后生命體征及血常規(guī)、肝功能、腎功能等檢查結(jié)果均無明顯改變;回輸后未出現(xiàn)不良反應(yīng)。2.3表1顯示了前后淋巴結(jié)的形態(tài)變化2.4表2顯示了再利用率前后的出血前后阿什貝林亞組的形態(tài)變化2.5個體是否個體的配比選擇5例多次回輸?shù)幕颊?觀察多次回輸后,不同次數(shù)回輸后2周外周血CD16+/CD56+細胞的百分比。圖1可以看出,不同個體間差距較大,不好比較;但針對每一個體觀察,回輸后外周血CD16+/CD56+細胞比例升高,而多次回輸并未呈持續(xù)上升趨勢,只是一直保持在較高狀態(tài)。其他亞群比例并無變化。3cd18+/cd56+細胞回輸?shù)陌踩苑治鋈绫?所示,外周血淋巴細胞在體外經(jīng)細胞因子刺激并擴增后CD16+/CD56+(%)細胞比例顯著升高,每次回輸?shù)募毎蠧D16+/CD56+細胞占45.6%±18.8%。回輸細胞在體內(nèi)的壽命目前不詳,但回輸2周后外周血中仍可檢測到CD16+/CD56+細胞顯著升高達26.4%±13.9%(表2),提示回輸?shù)募毎?周后仍有部分存活。以CD16+/CD56+細胞為主的NKTm細胞受MHC約束力較弱,對腫瘤細胞殺傷具一定廣譜性,故回輸后體內(nèi)CD16+/CD56+細胞的增加有助增強機體抗腫瘤能力,有助打破腫瘤免疫耐受狀態(tài)。一次回輸,2周后仍可看到外周血中CD16+/CD56+細胞比例顯著增高,提示NKTm細胞回輸具有較高的效率,可有效提高機體抗腫瘤免疫功能。各項臨床指標的觀察顯示,NKTm細胞回輸是安全的,未見不良反應(yīng)。表1顯示,在1次回輸后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞比例無顯著變化,CD16+/CD56+細胞的增多亦未引起不良反應(yīng),表明NKTm細胞治療在增強機體抗腫瘤免疫、克服腫瘤免疫耐受的同時,并未打破機體免疫平衡狀態(tài),不會引起免疫失衡所致的疾病,即使多次連續(xù)回輸,CD16+/CD56+細胞一直維持較高水平但未持續(xù)上升,其他各亞群比例基本未變。該結(jié)果提示NKTm細胞連續(xù)多次回輸是安全的。本研究顯示NKTm細胞回輸可以顯著提高機體抗腫瘤細胞免疫功能,多次連續(xù)回輸可以使這一功能保持在一個較高水平,有助于對體內(nèi)腫瘤細胞的持續(xù)殺傷,且具有良好的安全性。存在問題:盡管初步研究顯示出NKTm細胞回輸具有一定抗腫瘤臨床療效,但嚴格設(shè)計的隨機對照臨床研究仍十分必要;完成這樣的臨床研