低濃度zn和cd馴化杜氏鹽藻生長及cd吸收的比較

海洋微藻是海洋生產力的重要組成部分。對水環境的變化非常敏感。如果通過各種方式進入海洋中的污染物必然會導致生理生態變化。重金屬被認為是一類典型的積累性污染物,可通過海洋食物鏈傳遞富集而危害生態健康。作為重金屬進入海洋食物鏈的入口,微藻細胞吸收和排泄這些元素的程度將直接影響著高營養級生物體內金屬的含量,所以研究重金屬脅迫條件下海洋微藻的生理生態反應對了解重金屬元素在海洋環境的生物地球化學過程具有重要的意義。海洋微藻在金屬脅迫條件下,具有生理應激和防御反應,如產生植物螯合肽(phytochelatins)以降低金屬對機體的危害,其中Cd被認為是最強的誘導植物體產生植物螯合肽的金屬元素。Cd元素具有生物毒性,也有研究表明其具有營養元素的作用,可見該元素對生命體具有雙重性。進入到海洋環境中的污染物質種類和濃度常處于變化之中,微藻細胞面臨這種連續而不同的污染壓力將會產生何樣的反應還少見報道。本實驗主要研究了經過低濃度重金屬馴化的杜氏鹽藻在不同濃度Cd脅迫條件下的生長狀況,通過微分脈沖極譜法測定了微藻細胞體的Cd吸收量,以期了解受到不同重金屬影響的海洋微藻再度面臨重金屬脅迫時相應的生理應答。1材料和方法1.1培養基與培養方法實驗藻種選用對環境變化較為敏感的杜氏鹽藻(Dunaliellatertiolecta),分別經濃度為10μmol/L的Zn和1μmol/L的Cd溶液馴化后,將清洗好的藻細胞重新懸浮在新鮮培養基中作為接種藻液。培養基為f/2-Si營養鹽配方,海水采自大亞灣海域,經過0.45μm濾膜過濾;培養容器和培養基使用LDZX-40SBI型蒸汽滅菌器進行高溫滅菌(121℃,20min),培養容器為250mL錐形瓶。接種操作在超凈工作臺中進行,RXZ型智能人工氣候箱中培養,溫度(24±1.0)℃,光照126μmol/m2.s,濕度70%RH,14/10h光暗周期,每天搖瓶3~4次。細胞初始數約為2×105/mL,采用濃度稀釋法向各個實驗組藻液中加入1mL不同濃度CdCl2溶液,使處于指數生長前期的藻細胞分別暴露在濃度為0,5,20,50μmol/L的Cd脅迫生長條件下,培養10d。1.2藻細胞計數及比生長率統計藻細胞數測定采用血球計數板法,分別在鎘暴露0,1,2,4,7,10d時取樣,用Lugol’s試劑固定染色后計數。實驗使用NikonYS100顯微鏡,通過DT2000圖像采集軟件采集整個計數區圖像后準確統計藻細胞數目,每個樣本采集3次計數取其平均值。比生長率(μ)按下列公式計算:μ=(lnNt-lnN0)/t其中:N0表示初始藻細胞數;Nt表示t天后藻細胞數。1.3藻細胞濾過液處理暴露實驗結束后,分別量取50mL藻液(其中Cd暴露濃度高的實驗組,因生物量低取100mL藻液),使用0.45μmWatermanGF/C濾膜收獲藻細胞,濾膜用10mmol/LNa2EDTA和去離子水浸洗后,70℃干燥至衡重后稱量。收獲的藻細胞經過10mmol/LNa2EDTA充分浸洗以去除細胞表面吸附的重金屬元素,再用去離子水清洗兩次,經與濾膜前處理相同的干燥平衡程序后稱重,計算藻細胞生物量干重。1.4cd含量測定將收獲的藻細胞用體積比2∶1的HNO3和H2O2(GR,65%、30%)在70℃條件下消解至溶液透明,冷卻后用10mol/LNaOH中和溶液,調節pH在3~5,定容至50mL,同步作兩份試劑空白。樣品Cd含量通過797VAComputrace極譜儀(瑞士萬通)測定,取10mL待測樣品和1.5mL濃度1mol/L的醋酸緩沖液加入測試杯中。測試條件:微分脈沖模式(DP),懸汞電極(HMDE),富集時間60s;曝氣時間,300s;掃描電位,-1.20~-0.48V;脈沖電位,50mV;脈沖時間,0.04s;掃描速率,0.059V/s;支持電解質為醋酸緩沖體系。1.5uv水凈化系統所用試劑為優級純或分析純,極譜測試Cd、Zn標準溶液為1.000g/L(Merck,Germany)。去離子水使用Arium631UV水凈化系統(Sartorius)制取,使用容器均經過10%鹽酸浸泡48h。每個實驗組設3個平行樣,所示值為平均值±標準偏差。2結果和討論2.1cd對zn誘導藻比生長率的影響圖1分別為Zn馴化和Cd馴化的杜氏鹽藻暴露在0,5,20,50μmol/L的Cd濃度條件下的生長曲線,很明顯金屬Cd對藻細胞具有較強的毒害性和抑制生長的作用。從圖中可知對照組藻細胞0~6d處于指數生長期,平臺期細胞數目分別達到8.3×105和7.2×105/mL。5μmol/LCd濃度藻組在暴露初始,細胞生長要強于對照組,說明低濃度Cd在短時間內具有激發細胞分裂的能力;該濃度Cd暴露的Zn馴化藻生長曲線與對照組較為接近,Cd致毒性似乎不是很明顯,而Cd馴化藻在暴露第4d進入生長平臺期,隨后有細胞致死現象。暴露在Cd濃度為20μmol/L的藻細胞生長則受到顯著的抑制作用,均在暴露第二天進入生長停滯期,細胞數目維持在4.2×105/mL左右。Cd濃度50μmol/L的藻組則幾乎沒有生長現象,藻細胞在該條件下已經無法分裂繁殖。計算Cd對Zn馴化藻與Cd馴化藻的半抑制濃度(IC50)分別為29和26μmol/L,說明Zn馴化藻耐受Cd毒害的能力要強于Cd馴化藻。為比較不同時段相同Cd脅迫條件下兩種金屬馴化的杜氏藻生長率的變化情況,文中比生長率都以相鄰的前次采樣結果為初始值(N0)來計算。圖2即為Zn和Cd馴化藻在不同Cd脅迫條件下的比生長率對比情況,從圖中可知除50μmol/LCd暴露組因存在致死和恢復生長現象而使得曲線變化不穩,其它藻組比生長率基本上表現出相類似的變化規律。其中,最大比生長率均出現在第一天,且Zn馴化組數值都明顯的大于Cd馴化組;暴露在5,20μmol/LCd的Zn藻組最大比生長率都高于對照組,分別為0.36和0.33,同樣Cd馴化藻組最大比生長率也出現在低濃度Cd暴露組為0.24,說明較低濃度的Cd會刺激藻細胞加速生長。Cd暴露第2d,各組比生長率開始明顯降低,此時Cd馴化組的值開始稍大于Zn馴化組。暴露第7d,μ值都近于0,到第10d開始出現衰亡。依據比生長率的變化可看出Zn馴化的藻種生長能力強于Cd馴化的藻種,后者生長相對和緩,從每個藻組最大比生長率可知,Zn馴化藻的耐Cd毒性強于Cd馴化藻。微藻細胞在Cd脅迫條件下具有應激性,表現為初始分裂速度加快,隨后Cd抑制性使得生長幾乎停滯。2.2cd和zn含量的測定伏安極譜法測試準確、靈敏且消耗低,實驗選用微分脈沖模式(DP)測試藻細胞消解液中的Cd含量。采用標準加入法定量測試,可同步測定溶液中Cd和Zn的含量。加標溶液濃度為50μmol/L,加入體積在0.02~0.05mL。Cd峰電位為-0.58V,Zn峰電位-0.91V,圖3為一個樣品的U-I掃描圖和測定結果。2.3cd誘導藻細胞cd吸收金屬元素能力兩種馴化藻在不同濃度鎘暴露條件下收獲的細胞干重和細胞Cd吸收量見圖4,隨著Cd暴露濃度增加,收獲藻細胞干重也明顯的隨之降低。Zn馴化藻對照組細胞干重為51.9mg/L,略低于Cd馴化藻54.3mg/L,其它組含量則都高于Cd馴化藻,在10~50mg/L變化。測定藻細胞內Cd吸收量,結果表明暴露于20和50μmol/LCd條件下的Zn馴化藻組的含量相對較低,分別為20.17和31.58μg/109cells;而暴露于5μmol/LCd濃度條件下的藻細胞測得的Cd含量高達144.58μg/109cells,已略高于對應的Cd馴化藻組。Cd馴化組在Cd暴露條件下細胞內吸收的Cd含量都較高,分別為134.89,93.67,180.64μg/109cells。其中,低濃度Cd暴露組的Cd含量也相對較高,似乎不符合Cd脅迫濃度愈低,藻細胞Cd含量愈低的規律。可能由于該藻組細胞量相對大,且活力較強,吸附在細胞表面的Cd不容易被洗脫。藻細胞Cd吸收量與細胞干重經線性回歸,去除低濃度Cd暴露組,Zn和Cd馴化藻的Cd吸收量與收獲干重量線性回歸方程分別為:y=-3.921x+207.888和y=-0.822x+44.095;KCd=-3.921,KZn=-0.822;r=0.971,r=0.976(n=3)。回歸方程Zn馴化藻斜率值顯著小于Cd馴化藻,表明相同生物量的Zn馴化藻吸收Cd的數量偏低。研究表明Cd暴露能改變藻細胞的內部器官結構,如使液泡變大而更易吸收富集金屬元素;Zn暴露則會使藻細胞粒徑變小,但對細胞組織的影響則相對輕微,因此使得藻細胞吸收金屬的能力相對弱。這種性狀使得經過這兩種金屬馴化的杜氏藻再度面臨Cd脅迫時表現出較大的差異性。藻細胞中Zn含量的測定發現,凡Cd脅迫條件下藻細胞Zn的含量幾乎檢測不出來,Cd馴化對照組藻細胞內Zn的含量要顯著高于Zn馴化組,分別為(21.58±4.52)和(12.98±2.03)μg/109cells,進一步說明經Cd馴化的藻更容易吸附和吸收重金屬元素。另外,Cd馴化藻對照組細胞體內仍可以檢測出極微量Cd,說明一旦Cd元素進入細胞體內,就很難再代謝排出體外,而將隨著細胞分裂遺傳下去。3cd誘導藻細胞加速生長并吸收cd元素杜氏鹽藻經過低濃度Zn和Cd馴化后在不同濃度Cd脅迫條件下的生長曲線、比生長率及生物量干重等指標表明,Zn馴化藻的生長力和耐受Cd毒害的能力要強于Cd馴化藻。