水稻原生質體分離及轉化作者：植物逆境與光合實驗室|發表日期：2014-04-11實驗目的：用于做熒光定位、BIFC、Co-IP實驗實驗材料和試劑：生長8-10d的水稻組培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5mL移液槍、5mL槍頭、12mLBD管、1.5mLEP管、100mL錐形瓶、圓形培養皿、濾網(20mmx20mm)、離心機、搖床等。溶液的配制：母液的配制：1、 0.2MMES(pH5.7)2、 0.8MMannitol(甘露醇)3、 1MCaCl24、 2MKCl5、 2MMgCl26、 10%BSA[FlukaPEG400081240]以下如有上述母液，則都是使用的母液酶解液：20mL x2MES 0.5MannitolmL-35：『…，ddH2OmL55°C10min冷卻至RT后加入200uLCaCl2加入200uL10%BSAMmg:20mLMESmLMannitolmLMgCl2mLddH2OmL7.515mL0.150.3g0.0750.15g1.83.6mLx20.20.4mL510mL0.0750.15mL4.7259.45mLPEG-CaCl2:PEG-CaCl2:20mLMannitolmLCaCl2mLPEG4000gddH2OmLx22.5mL12mL48g3TOC\o"1-5"\h\zmLW5:200mLMES 2mLNaCI 1.8gCaCl22H2O 3.67525gKCI 0.5mLddH2O 197.5mL具體實驗步驟：1、 從培養基上切取培養8-10d的水稻幼苗，去除幼苗外層包裹的葉子。2、用干凈的刀片將幼苗切成很細的粉末狀碎片（越細越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗莖稈的中間段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。3、將酶解液（約20mL）倒入100mL錐形瓶中，然后輕輕地將細碎的幼苗倒入錐形瓶中（注意不要撒到錐形瓶壁上），然后輕輕地搖晃，使其均勻分散。4、 黑暗條件下（用不透光的黑色塑料袋包裹即可，下同）置于搖床中（60rpm/min）搖晃5h，使細胞充分酶解。此時也可以將PEG-CaCl2溶液一同置于搖床上搖晃，使溶質充分溶解。5、 從搖床中取下已經酶解好原生質體的錐形瓶，用手輕輕搖勻后，再用移液槍吸取錐形瓶中已經酶解好的液體，讓其經過過濾網（20mmx20mm）過濾后流入到BD管中。6、 接著用W5溶液來洗滌錐形瓶中剩余的殘渣，然后同樣用移液槍將其吸出，經過過濾網后流入到BD管中，此步驟按照需要重復2-3次（盡量收集到更多的原生質體），所需要收集原生質體的BD管數按照需要來決定。7、 收集完后，將含有原生質體的BD管置于離心機中，1200rpm離心3min。8、 去掉BD管中的上清后，用W5溶液（約6mL）洗滌沉淀，然后1200rpm離心3min。9、 重復步驟8一到兩次。10、 去掉BD管中的上清，再在含有沉淀的BD管中加入mmg（加入的量根據液體的顏色來自行判斷），然后將其混勻。11、 Mmg加入完畢并混勻后，可吸取其中少量液體到計數板上，然后置于顯微鏡下觀察（主要是查看原生質體是否完整、濃度是否達到和是否還含有大量的雜質），有時候憑經驗而可以省去這一步。12、 接著將BD管中的液體轉移到事先已經裝有質粒的另外的BD管中（加入的量根據每100uL原生質體中加入10-20ug質粒來確定，如果是雙轉，則每一種質粒都要加入這么多的樣，即雙倍的質粒），在這里可以轉小量GFP對照來測定原生質體的轉化效率。13、 再加入等體積（原生質體+質粒）的PEG-CaCl2溶液（溶液比較粘稠，注意慢慢吸取），輕輕混勻。14、 黑暗條件下靜置15min（讓質粒轉入原生質體中）。15、 然后加入1-2倍體積的W5溶液（終止反應）。16、 混勻后，1200rpm離心3min，倒去上清。17、 在沉淀中加入少量W5（約1mL）混勻。18、 最后將其吸取倒入事先加有6mLW5的培養皿（事先經過胎牛血清潤洗，以便原生質體均勻分散在培養皿中）中，并混勻。19、 黑暗條件下靜置培養16h（讓質粒在原生質體中表達出蛋白）。20、 從黑暗中取出培養的原生質體，待吸去培養皿中一部分清澈的液體后，再用槍頭將培養皿中剩余的液體和原生質體打勻，然后用移液槍將其吸取至新的BD管中。21、 接著將BD管中的原生質體分裝到1.5mL的EP管中（分裝的管數按需求決定）。22、 此時可在EP管中加入不溶的PGN和Chitin進行處理，處理濃度為200ug/mL,處理時間為10min，處理時可上下顛倒搖晃EP管，這能讓PGN和Chitin充分處理到原生質體。23、 然后將EP管置于離心機中，12000rpm，離心1min。24、 吸去EP管中的上清液，然后迅速將其置于液氮中，最后置于-80°C中凍存，待需要使用時再取出。一、4注意：1、 配制溶液前需配制相關試劑母液，而且需要過濾除菌。2、 溶液配制好后也需要過濾除菌。3、 所用的器具最好是平時專門使用的，防止交叉污染。4、 由于原生質體容易破裂，所以搖晃、打勻和轉移原生質體的時候動作必須要輕。實驗一：GFP轉原生質體轉化效率觀察黑暗條件下靜置培養16h（讓質粒在原生質體中表達出蛋白），取出已表達出GFP蛋白的原生質體，將原生質體打勻后再將其吸入2mLEP管，然后1200rpm離心3min，吸取大部分上清后再打勻原生質體，最后吸取少量原生質體置于載玻片上，接下來便可在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光了。實驗二：用于BIFC實驗實驗三：用于Co-IP實驗此方案來源于YangZhang,JianbinSuandHongbinWang*.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransie