基于pcr技術(shù)的地方豬種黑素皮質(zhì)素受體1的位點(diǎn)分析

動(dòng)物的彩色表面主要由黑色素皮質(zhì)素受體1（mc1r）引起的不同等位基因調(diào)整組成。MC1R為G蛋白耦合受體,有7個(gè)跨膜功能域,其天然配體為黑素皮質(zhì)素激素肽。MC1R在黑色素細(xì)胞中表達(dá),與天然配體α-促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)相互作用,經(jīng)由G蛋白耦合的cAMP信號(hào)通路,調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終經(jīng)多巴或多巴鉻合成各自的衍生物-褐黑素細(xì)胞和真黑色素,在動(dòng)物中呈現(xiàn)不同的毛色或羽色。豬MC1R基因定位于6號(hào)染色體短臂末端,靠近端粒區(qū),由948bp的單一外顯子構(gòu)成。目前,已知豬MC1R基因存在5個(gè)等位基因:E+對(duì)應(yīng)于野豬的野灰毛色表型;ED1對(duì)應(yīng)于歐洲大黑豬和中國(guó)梅山豬的黑毛色表型;ED2對(duì)應(yīng)于漢普夏的黑毛色表型;Ep對(duì)應(yīng)于皮特蘭的斑塊表型;e對(duì)應(yīng)于紅毛杜洛克表型。我國(guó)豬種資源豐富,毛色各異,如烏云蓋雪式(黑背白腹)的萬(wàn)安花豬、白帶表型(頭尾黑,中間白)的金華豬等。為研究我國(guó)地方豬種MC1R基因?qū)γ硇偷恼{(diào)控,本研究選用16個(gè)全同胞家系,采用PCR-RFLP、PCR-SSCP技術(shù)手段,得到MC1R座位對(duì)毛色決定作用的一些認(rèn)識(shí);同時(shí),采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)手段相結(jié)合,檢測(cè)了6個(gè)地方品種:兩頭烏(金華豬、上高兩頭烏)、黑豬(玉山黑豬、嘉興黑豬)、花豬(樂(lè)平花豬、嵊縣花豬)MC1R座位等位基因分布頻率及基因型頻率,首次在嵊縣花豬中發(fā)現(xiàn)一個(gè)PCR-SSCP證據(jù)的MC1R基因新序列。1材料和方法1.1種豬及牧良種場(chǎng)耳組織樣來(lái)自16個(gè)全同胞家系和6個(gè)地方豬種,16個(gè)全同胞家系情況見表1。6個(gè)地方豬種為:金華豬58頭,采自浙江省金華市種豬場(chǎng);嘉興黑豬57頭,采自浙江省嘉興市畜牧良種場(chǎng);上高兩頭烏45頭,采自江西省上高縣畜牧良種場(chǎng);樂(lè)平花豬32頭,采自江西省樂(lè)平市畜牧良種場(chǎng);玉山黑豬55頭,采自江西省玉山縣畜牧良種場(chǎng);嵊縣花豬58頭,采自浙江省嵊州市畜牧良種場(chǎng)。采樣方式為隨機(jī)抽樣。1.2耳組織的dna提取按照常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。1.3pcr-bsph-rflp分析引物MC1R1根據(jù)Kijas提供序列合成,擴(kuò)增MC1R位點(diǎn)3′端405bp片段,用于PCR-AccⅡ-RFLP分析;引物MC1R2根據(jù)Kijas提供序列合成,擴(kuò)增MC1R位點(diǎn)5′端428bp片段,用于PCR-BspHⅠ-RFLP分析;引物MC1R3根據(jù)MC1R基因序列(GenBank),Oligo4.0分析軟件設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增含AccⅠ酶切位點(diǎn)的184bp片段。引物序列為:MC1R3-F:5′-CGC,TCA,TGG,CGG,TAC,TGA,A-3′;MC1R3-R:5′-GGA,GAG,GTG,CAG,GAA,GAA,GG-3′。1.4pcr-acc-rflp的基因型判定根據(jù)引物MC1R1的PCR-AccⅡ-RFLP和引物MC1R2的PCR-BspHⅠ-RFLP的檢測(cè)結(jié)果,初步確定個(gè)體的MC1R基因型(表2);再進(jìn)一步利用引物MC1R3的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析,以最終確定具體的MCIR基因型(表3)。例如,某個(gè)體PCR-AccⅡ-RFLP的酶切帶型為3條帶,PCR-BspHⅠ-RFLP的酶切帶型為1條帶的基因型有E+/ED1、E+/e兩種可能;再根據(jù)該個(gè)體引物MC1R3的SSCP帶型進(jìn)行具體基因型判定。如表3所示,若PCR-SSCP帶型兼有大白豬和梅山豬的SSCP帶型,則綜合PCR-SSCP和PCR-BspHⅠ-RFLP、PCR-AccⅡ-RFLP分析結(jié)果,該個(gè)體僅有E+/ED1一種可能。PCR-SSCP分析采用15%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺=49∶1)。2μlPCR產(chǎn)物加入10μl上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.5mol/LEDTA(pH8.0)、0.05%二甲苯青FF、0.05%溴酚藍(lán)],混勻后,98℃變性5min后上樣,4℃7V/cm電壓電泳。電泳后銀染顯帶觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1p、33b葉片AccⅡ-RFLP酶切后得到405bp、222bp、183bp3條片段(圖1);BspHⅠ-RFLP酶切后得到428bp、256bp、172bp3條片段(圖2)。2.2sscp帶型與基因型的關(guān)系經(jīng)SSCP電泳后可見等位基因ED1、e與E+、EP、ED2帶型相異,而E+、EP、ED2帶型相同,部分個(gè)體的SSCP帶型與基因型關(guān)系如圖3所示。嵊縣花豬中新發(fā)現(xiàn)一特異序列,如圖4箭頭所示。2.3mc1r給藥回收單豬mc1r排放系統(tǒng)mc1r本研究采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)手段相結(jié)合,檢測(cè)了兩頭烏(金華豬、上高兩頭烏)、黑豬(玉山黑豬、嘉興黑豬)、花豬(樂(lè)平花豬、嵊縣花豬)等3類毛色表型6個(gè)地方豬種的MC1R座位等位基因分布頻率及基因型頻率(表4)。2.4基因型的檢測(cè)本研究對(duì)16個(gè)全同胞家系的MC1R位點(diǎn)運(yùn)用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法檢測(cè)基因型,并對(duì)毛色表型進(jìn)行分析。本文選取一典型家系的分析結(jié)果如表5所示。3基因型的確定利用PCR-SSCP和PCR-RFLP相結(jié)合的方法分析地方豬種的MC1R基因型,因外來(lái)豬種的MC1R基因型已知,根據(jù)分離規(guī)律即可得到家系后代的基因型,簡(jiǎn)化了毛色分析的復(fù)雜性。皮特蘭與二花臉家系子代個(gè)體基因型為ED1/EP時(shí),毛色為全黑;從表5可以看出,杜長(zhǎng)南家系的6號(hào)個(gè)體基因型為ED1/e,毛色為全黑。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Legault、Kijas等人的結(jié)果:ED1對(duì)EP、e為完全顯性。有些個(gè)體基因型雖相同,但表現(xiàn)出白色斑塊,則可能這些個(gè)體的顯性白毛調(diào)控基因(KIT位點(diǎn))不為隱性純合狀態(tài)。表5中的5號(hào)、8號(hào)個(gè)體基因型為EP/e,毛色表型既呈現(xiàn)出EP的斑點(diǎn),斑塊表型又呈現(xiàn)出e的紅毛色表型,可見EP對(duì)e為不完全顯性。從地方豬種基因型頻率的計(jì)算結(jié)果來(lái)看,ED1在不同地方豬種間占有顯著頻率:金華豬的ED1基因頻率為1;上高兩頭烏為0.9608;嘉興黑豬為0.9368;玉山黑豬為0.9603;嵊縣花豬中為0.8708;樂(lè)平豬為0.7656。這說(shuō)明我國(guó)地方豬種的黑毛色可能主要由顯性黑等位基因ED1調(diào)控。這些數(shù)據(jù)從側(cè)面也反映金華豬在所測(cè)品種中毛色基因最純,樂(lè)平花豬有較多非品種血源滲入;除金華豬外,外來(lái)豬種特有的ED2、EP等位基因在所測(cè)地方品種中均有一定頻率,表明一些在外來(lái)豬種中發(fā)現(xiàn)的等位基因在中國(guó)地方豬種也存在;E+等位基因在某些品種內(nèi)的少量存在似乎表明這些品種在由野豬馴養(yǎng)成家豬過(guò)程中,毛色表型上受到較少的選擇。PCR-SSCP分析嵊縣花豬基因型時(shí),發(fā)現(xiàn)兩特異條帶。該特異條帶的出現(xiàn)有可能源于曾對(duì)我國(guó)地方豬種改良起過(guò)貢獻(xiàn)的巴克夏豬、蘇白豬、克米洛夫豬中特有的等位基因;或是在長(zhǎng)期選擇過(guò)程中形成的對(duì)毛色表型無(wú)影響的突變,可進(jìn)一步測(cè)序比較ES與其他等位基因的序列異同。MC1R位點(diǎn)的基因型檢測(cè)有利于種豬純度的鑒別。例如,大白豬如果與杜洛克豬雜交,由于KIT位點(diǎn)的顯性上位作用,雜交子代仍為白毛色,購(gòu)買者不一定能從外形上判定出它為雜種;如果能對(duì)MCIR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),則從基因型上可以容易地作出判斷,因?yàn)榧兎N大白豬MC1R位點(diǎn)的基因型為EP/EP,大