淺談幾種菌根菌的分離培養

1牧草研究歷史和分類1.1放線菌結瘤植物的固氮能力在國外，關于法蘭克福的細菌的研究正在推遲。1829年，有一篇關于類腫瘤的報道。國內對弗蘭克氏菌與放線菌結瘤植物研究起步較晚。1977年，中國科學院植物生理研究所曾探究放線菌結瘤植物木麻黃、胡頹子的固氮能力；1978年，中國科學院林業土壤研究所在全國范圍內開展弗蘭克氏菌宿主植物的資源調查，表明我國放線菌結瘤植物種類豐富，有5科6屬44種自1964年對弗蘭克氏菌進行命名后的十四年間，對弗蘭克氏菌的研究進展一直十分緩慢，大部分研究重心在資源調查與形態描述等宏觀層面。1978年Callaham等1.2定種行為的研究方向弗蘭克氏菌的鑒定比較復雜，目前研究進展尚未滿足確定的分類標準，所以當前世界公認弗蘭克氏菌只分類到屬，沒有確切的種名。1970年，Becking根據弗蘭克氏菌與宿主植物的關系將其劃分為10個種，但因弗蘭克氏菌對宿主的非專一性導致的交叉侵染能力不同使得該分類方法沒有被認可隨著中性理論的提出、核酸演化速率的精準計算、分子鐘的廣泛應用和分子生物學的飛速發展，近二十年對定種問題的研究逐漸趨向于微觀領域。合理運用DNA-DNA雜交、免培養技術、16SrRNA高變區探針、高通量測序、特異性蛋白圖譜及rm和nif基因序列分析、DNA限制性片段長度多樣性（RELP）隨機擴增DNA片段多態性（RAPD）等方法，對弗蘭克氏菌的研究提高到一個新的水平，對分類到種的研究具有推動性。依據Lechevalier判斷標準，有如下定義標準為弗蘭克氏菌的形態特征觀察與初步鑒定提供借鑒：（1）分離出的菌株可以在宿主植物上誘發形成有效或無效根瘤，并能從根瘤中重新分離到純培養；（2）可以在液體培養基中產生不動孢子的孢囊，有時可以形成泡囊2甲醇菌的形態特征和栽培特征2.1絲、孢囊、泡囊弗蘭克氏菌的純培養過程中，其經典形態結構為菌絲、孢囊、泡囊，特殊結構為串珠狀菌絲(1）菌絲：植物體外培養環境下呈分枝狀，粗細不均，波曲程度各有差異，菌絲有橫隔，直徑0.2～1.5μm2.2弗蘭克氏菌培養特征弗蘭克氏菌是一類生長緩慢、用液體培養基培養和保存的微好氧放線菌。一般來講，弗蘭克氏菌的菌絲體常有的液體培養特征是在培養器的底端附著程度差別較大，菌落形態多呈絮狀、顆粒狀、圓球狀、少數呈片狀。一些菌株可以在固體培養基上生長，一般2～3周才能看見菌落，一些菌落可生長半年以上3分辨率與保存技術3.1酚類化合物干擾內生菌的分離與培養導致弗蘭克氏菌研究進展緩慢的主要因素是難以獲得純培養菌株，分析原因如下：（1）弗蘭克氏菌在人工培養環境下生長緩慢，需半個月到一個月方可長成。（2）人工培養基難以滿足根瘤內生菌營養方式與要求的轉變。（3）環境中其他微生物的侵染、污染等。（4）根瘤內部產生酚類化合物干擾內生菌生存隨著對酶解法研究的深入，人們發現影響分離培養成敗的關鍵因素是合理選用表面消毒劑和消毒時間，而對根瘤切片進行的酶處理只是有利于內生菌從宿主細胞中釋放出來。根據目前全球各研究所分離情況可知，當前的弗蘭克氏菌仍然是生長極其緩慢的，需要一年多才有較好的觀察特征，這樣的生長速度無法滿足基礎研究需求，更無法滿足未來田間試驗與廣泛應用，因此加快分離菌株的生長速度成為亟待解決的問題。為解決此問題，在分離和生長培養基中一般要額外添加特殊促生長因子，譬如從赤楊皮根周圍的油脂提取出來的三萜烯、龍腦香醇酮或類黃酮Bassi等將吉蘭糖膠作為一種膠凝劑和特定的蛋白胨而制成的一種新型固體培養基，在培養3d后可用肉眼觀察到弗蘭克氏菌HFPCc13的衍生物。綜上可知選擇正確的培養基對弗蘭克氏菌的分離可起到事半功倍的效應3.2弗蘭克氏菌株的保存技術到目前為止，已從木麻黃、楊梅、沙棘等諸多放線菌結瘤植物中得到弗蘭克氏菌的純培養菌株，但是弗蘭克氏菌生長速度緩慢，對分離條件要求較高，且容易感染雜菌，因此如何妥善保存現有菌株顯得尤為重要。蘇巖鳳等4弗蘭克氏菌侵權形成根瘤根據固氮菌與宿主和環境的關系可將生物固氮分為自生固氮作用、聯合固氮作用與共生固氮作用，而以根瘤菌主導的豆科植物共生固氮體系、以弗蘭克氏菌與叢枝菌根為主的非豆科共生固氮體系與固氮藍細菌主導的藍藻共生體系共同組成共生固氮作用從根毛細胞侵染與根部薄壁細胞間隙侵入是弗蘭克氏菌侵染宿主植物進行結瘤最常見的兩種方式。例如，在弗蘭克氏菌共生體系中木麻黃科植物與弗蘭克氏菌結瘤是通過侵入根毛細胞內的感染方式結瘤，在胡頹子科中，早期的結瘤起始很可能通過從根毛表皮細胞間侵入形成根瘤。(1）根毛侵染。弗蘭克氏菌附著在根毛表面，引起根毛形態發生變化導致菌絲容易穿過細胞壁進入細胞形成內生菌。植物在感受到放線菌入侵后會發生應答反應，產生分泌物形成莢膜結構覆蓋菌絲表面進而擴展到整個皮層細胞，皮層薄壁細胞經過分裂生長最后形成根瘤。隨著菌絲體的不斷生長，會激活中柱鞘細胞形成內源初生根瘤原基，再發育成根瘤分生組織，最后形成完整的根瘤。（2）細胞間侵入。這種侵染方式常見于胡頹子科，因胡頹子科根毛較少，弗蘭克氏菌穿入細胞間，在侵染過程中不使根毛變形。弗蘭克氏菌附著在根毛表面后侵染角質層，菌絲在表皮細胞間侵入細胞間隙，在中柱鞘形成初生根瘤原基，當穿破根部細胞表皮后進而產生莢膜轉為內生菌，最終形成根瘤組織。弗蘭克氏菌與非豆科植物共生結瘤固氮具有以下特征：（1）專一性不強。弗蘭克氏菌與宿主的共生關系沒有根瘤菌與豆科植物間那么嚴格，宿主間的親緣關系遠近不同，與根瘤菌與豆科植物共生固氮對比明顯我國對弗蘭克氏菌的研究取得一定進展，但弗蘭克氏菌獨特的結構特性與生理特性導致的分離培養困難問題亟待解決，探索新型培養基與新的分離方法有望成為