灰樹花菌絲體-葡聚糖的安全性評價

灰木花（又名紅景天、堿性），又名栗子苗、蓮花、貝葉多孔菌、干佛菌、科其吉、云扇菌、日本舞蹈桿菌等。灰樹花為我國部分地區的習用食用菌,有長期食用歷史但未發現有害作用。有關灰樹花菌絲體β-葡聚糖的毒理和代謝等食用安全性方面的基礎研究很少,尤其是特殊毒性研究還很不系統。本研究主要針對灰樹花菌絲體β-葡聚糖的食品毒理學進行探討,以期為灰樹花菌絲體β-葡聚糖的應用提供一定的參考。1材料和方法1.1實驗動物與儀器受試菌株是從野生環境中的天然菌株分離篩選并經過長期馴化得到的,經中科院微生物所鑒定為灰樹花(Grifolafrondosa(Dichs.exFr.)S.F.Gray),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCNo.1709受試物灰樹花β-葡聚糖為白色粉末,由灰樹花發酵菌絲體提取純化獲得,含量為30%,由山東仁和生物有限公司提供,批號為:20060802。推薦日用量200mg。清潔級昆明種小鼠:7~12周齡,體質量25~30g;清潔級Wistar大鼠:體質量50~70g。均由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所動物繁育場提供(許可證號:SCXK11-00-0006)。實驗動物使用許可證號:SYXK(魯)20030006。多氯聯苯、瘧的平、正定霉素、疊氮鈉、絲裂霉素、二氨基芴(2,7-diaminofluorene,2-AF)均為國產醫藥級。HY318全自動血細胞分析儀法國Celly公司;HITACHI7180全自動生化分析儀日本日立公司;DMLB顯微鏡徠卡公司;DYML-S50A高壓滅菌器北京勤誠盛達科學儀器有限公司;FA2104電子天平上海上天精密儀器有限公司;載玻片、血細胞計數板、勻漿器、容量瓶、冰箱、培養皿、注射器、解剖剪、鑷子。1.2方法參照GB/T15193—2003《食品安全性毒理評價程序和方法》1.2.1大、小鼠經口急性毒性試驗觀察采用最大限量法。選擇雌雄小鼠各10只,體質量18~22g。受試物劑量為20g/kgbw,分兩次灌胃給予受試物,每次灌胃0.2mL/10gbw,間隔4h,記錄動物的中毒表現及死亡情況,連續觀察14d。1.2.2小鼠精子畸形實驗微生物回復突變實驗(Ames實驗,平板滲入法)、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗、精原細胞染色體畸變實驗與小鼠精子畸形實驗均按文獻[7-8]進行。各實驗所用陰性對照為滅菌蒸餾水,陽性對照為環磷酰胺(40mg/kgbw)。按照《食品安全性毒理評價程序和方法》的要求,Ames實驗受試樣品的毒性由預實驗獲得,需設置5個劑量,且最高劑量為5mg/皿;骨髓嗜多染紅細胞微核實驗受試樣品劑量一般取LD1.2.3大鼠食物利用率測量選用體質量50~70g的斷乳大鼠80只,隨機分成4組,每組20只,雌雄各半。根據人體推薦劑量設立3個實驗組,受試物劑量分別為0.1、0.2、0.4g/kgbw(分別相當于人用推薦劑量的30、60、120倍),將受試物摻入飼料中,按照動物體質量的10%計算食物攝入量(即受試物質量占食物質量的0.1%、0.2%、0.4%)飼喂實驗動物。對照組大鼠飼喂基礎飼料。單籠喂養,自由飲食,每周稱質量,記錄飼料加入量、剩余量。進食量為加入食物量和食物剩余量的差值,食物利用率=一定時間內動物體質量的增加量/一定時間內動物的進食量。連續觀察30d。第30天按照參考文獻[7]進行血像、生化指標、臟器系數等指標測定。2結果與分析2.1急性中毒試驗的結果灌胃給予受試物后,雌、雄小鼠均未出現中毒癥狀,14d內實驗小鼠無死亡。即該受試物對雌、雄小鼠的急性毒性LD2.2遺傳毒性試驗的結果2.2.1劑量-反應關系受試物各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍,也不呈劑量-反應關系。說明在加與不加S-9時,該樣品對4株鼠傷寒沙門氏菌實驗株TA97、TA98、TA100、TA102均未呈現遺傳毒性,即微生物回復突變實驗結果為陰性(表1)。2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果經Poisson分布檢驗結果表明,受試物各劑量組與陰性對照組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無顯著性差異(P>0.05),而陽性對照組與陰性對照組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率有極顯著性差異(P<0.01),說明該受試物無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用,小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果為陰性(表2)。2.2.3小鼠精原細胞染色體畸變實驗與小鼠精原細胞染色體畸變實驗的相關性由表3可見,受試物各劑量組與陰性對照組小鼠精原細胞染色體畸變率相比無顯著性差異(P>0.05),而陽性對照組與陰性對照組小鼠精原細胞染色體畸變率有極顯著性差異(P<0.01),說明該受試物無致小鼠精原細胞染色體畸變作用,小鼠精原細胞染色體畸變實驗結果為陰性。受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率相比無顯著性差異(P>0.05),而環磷酰胺陽性對照組小鼠與陰性對照組的小鼠精子畸形率有極顯著性差異(P<0.01),該受試物無致小鼠精子畸形作用,小鼠精子畸形實驗結果為陰性。2.3大鼠30天的喂養實驗2.3.1拒食及正常活動在大鼠30d喂養實驗中,各試驗組動物均未出現拒食現象,活動正常。由表4、5可知,各實驗組大鼠與對照組大鼠的體質量、進食量、食物利用率無顯著性差異(P>0.05)。2.3.2蛋白、紅細胞及谷丙治療的基因型指標從表6、7可知,與對照組比較,各實驗組大鼠血紅蛋白、紅細胞總數、白細胞總數及其分類、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌苷、膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白等指標均無顯著性差異(P>0.05)。2.3.3臟器異常大體觀察各實驗組大鼠未發現異常,解剖時亦未發現膀胱、肝總管結石,臟器系數未見異常(表8)。其他臟器如脾、腎、腸、睪丸、卵巢等均未見明顯異常。與對照組相比未出現有意義的病理改變。3種毒方法檢測細胞染色體損傷本研究中,小鼠急性毒性實驗結果表明,受試物灰樹花菌株GF-932發酵的菌絲體β-葡聚糖LDICH推薦的遺傳毒性實驗標準組合是:一項細菌基因突變實驗;一項哺乳動物細胞染色體損傷細胞遺傳學評價或小鼠淋巴瘤TK檢測體外實驗;一項嚙齒類動物造血細胞染色體損傷實驗;這3個組合符合國際有關的遺傳毒性實驗標準組合食品安全性毒理學評價分為4個