光鏡下觀察組織標本需克服的幾個問題

如何保持組織標本取材前的形態？如何制備薄組織片，允許光的通過而便于觀察？如何使不同組織結構具有不同的光折射率，便于對標本進行結構的仔細辨別？光鏡下觀察組織標本需克服的幾個問題如何保持組織標本取材前1光鏡標本的基本制作技術第二章光鏡標本的基本制作技術第二章2光鏡樣本的基本制作技術（組織制片技術）是醫學研究和生物學研究中，觀察細胞、組織的正常或病理形態變化的一種必不可少的手段，借此可以彌補活體觀察的不足同時光鏡樣本的基本制作技術也是其它光鏡標本技術的基礎光鏡樣本的基本制作技術（組織制片技術）是醫學3取材固定漂洗脫水透明浸蠟包埋切片脫蠟

染色脫水透明封片光鏡樣本的制作的基本過程取材固定4第一節取材及固定醫學研究的組織樣本來源人體（最好）臨床的活檢組織尸檢組織（取材方法及注意事項按病理學要求進行）正常組織用正常動物的組織材料替代第一節取材及固定醫學研究的組織樣本來源5一、動物致死法

動物的福利，3R原則

動物致死法選擇致死動作應迅速一、動物致死法動物的福利，3R原則6常規石蠟制片HE染色技術ppt課件71．斷頭法2．擊頭法3．麻醉法4．股動脈放血法5．空氣栓塞法動物致死方法1．斷頭法動物致死方法8細胞標本制備1.印片法2.穿刺法3.沉淀法4.培養細胞標本制備細胞標本制備1.印片法9二、取材及注意事項1．材料保持新鮮2．組織塊免受擠壓3．組織塊力求小而薄4．盡量保持組織的原有形態5．選取好組織塊的切面6．動物品種的選擇和熟悉取材的解剖位置7．切除不需要的部分8．保持材料的清潔二、取材及注意事項1．材料保持新鮮10三、組織固定法

固定是使要觀察的組織構造盡量接近它取材前的狀態三、組織固定法固定是使要觀察的組織構造盡量接11（一）固定目的1．標本不發生離開身體后或死后變化2．隨后處理中，標本不易損壞3.組織塊硬化4．使組織內各種結構產生不同的折光率，或對染料具有不同的親和力（一）固定目的12

（二）固定方法1．蒸氣固定法（較細小而薄的標本）2．小塊組織固定法（直接投入固定液中）3．注射、灌注固定法（體積過大或固定液極難滲入內部的組織標本）（1）局部灌注固定（肺、肝、腎、腦等）（2）全身灌注固定（小鼠、大鼠、兔、狗、猴、人）4.微波固定法（二）固定方法13常規石蠟制片HE染色技術ppt課件14

灌注過程充分暴露心臟針尖插入左心室或升主動脈中快速灌注生理鹽水剪開右心耳（或右心房）放血換灌固定液，先快后慢輸入灌注過程15

用量1.生理鹽水大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、貓200-250ml、猴300-500ml、狗800-1000ml2.固定液動物血液量的2倍動物體重（g）×7%×20（ml）用量16

無論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注完畢后，必須立即將組織塊、器官或整個動物再放入同樣的固定液中進行后固定無論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注171．組織塊不宜過大2．軟組織或較大塊組織可先經2~3小時固定后，再修整成小塊重投入新配制的固定液內繼續固定3．固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜，在固定組織的瓶底墊上脫脂棉、數層紗布或濾紙4．固定時間的長短視固定劑的種類、溫度、組織塊的大小而定（三）固定注意事項及影響因素1．組織塊不宜過大（三）固定注意事項及影響因素181．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是37%~40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液濃度是10%，而實際甲醛濃度只有4%固定小塊組織(15×15×2mm)10小時左右經它長期固定的組織，需經24~48小時的自來水流水沖洗四、固定液（一）單純固定液1．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是3719

甲醛單純固定液的常用配方10%甲醛水溶液37%-40%甲醛液10ml自來水或蒸餾水90ml10%甲醛生理鹽水溶液37%-40%甲醛液10ml氯化鈉0.85g自來水或蒸餾水90ml甲醛單純固定液的常用配方20

2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，在熱水中可解聚成甲醛單體而溶解，在接近水的沸點時溶解極快；也可溶解于弱堿中。多聚甲醛溶液實際上是新配制的甲醛液，宜臨用前配制2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，21

4%多聚甲醛單純固定液的常用配方

多聚甲醛4g蒸餾水（或0.2mol/LPB）50ml在通風櫥內加熱使之完全溶解，然后冷卻0.2mol/LPB（或蒸餾水）～100ml

4%多聚甲醛單純固定液的常用配方22

3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的保存組織結構，但其穿透力弱，作為單純固定液多用于電鏡技術中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用時需配制成1%~6%的不同濃度3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的23

4．酒精：單純固定液為80%~95%的濃度，不必水洗而直接脫水。多用于組織化學中的糖原固定酒精固定的組織易變硬和發脆、組織收縮較大，所以不易長時間停留其中（70%酒精除外）可作為配制混合固定液的基本成分4．酒精：單純固定液為80%~95%的濃度，245．其它固定液丙酮苦味酸醋酸重鉻酸鉀三氯醋酸鉻酸氯化汞鋨酸5．其它固定液25

用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達到各試劑在固定作用中具有的優缺點平衡目的（二）混合固定液用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達26常用混合固定液1．酒精-甲醛液（A-F液）95%或無水酒精（A）90ml37%~40%甲醛液（F）10ml2．Carnoy液冰醋酸10ml氯仿30ml無水酒精60ml3．Bouin液飽和苦味酸水溶液75ml甲醛液（37%~40%）25ml冰醋酸5ml常用混合固定液1．酒精-甲醛液（A-F液）27

4．Helly液重鉻酸鉀2.5g升汞5g蒸餾水100ml（以上是Helly儲存液）甲醛液(37%~40%)(臨用時加入)5ml5．1%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液多聚甲醛1g蒸餾水50ml在通風櫥內加熱使之完全溶解，然后冷卻25%戊二醛5ml0.2mol/LPB（pH7.4）～100ml4．Helly液28第二節固定后處理及切片一、組織修整固定結束后，將受擠壓或不需要的部分組織修切或整形，同時選擇好包埋面，稱組織修整。修整可在沖洗前、也可放在沖洗后第二節固定后處理及切片一、組織修整29二、組織洗滌洗去滲入組織內的固定液，再進行下一步驟的操作；否則會妨礙染色效果，或引起沉淀、結晶而影響觀察，也可能會繼續發生化學反應造成后道操作困難1．水洗滌法：凡用水配制、或含鉻、鋨等的固定液所固定的組織塊，需用水洗滌2．酒精洗滌法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的組織塊，多采用酒精洗滌二、組織洗滌洗去滲入組織內的固定液，再進行下30三、組織脫水（一）脫水意義與脫水劑因水和石蠟不能相溶，而組織經固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蠟進行包埋。需用某些溶劑逐步置換組織塊中的水分，稱脫水脫水劑必須具有下列特性：1）脫水劑能與水按任意比例混合；2）脫水劑高濃度時不含水分；3）脫水劑也能與透明劑按任意比例互相混合三、組織脫水（一）脫水意義與脫水劑31脫水劑中最常用的是酒精。一般從70%酒精開始脫水，逐步升高酒精濃度；脫水時間根據組織塊的種類、大小、及使用的固定液種類等因素而定脫水劑中最常用的是酒精。3270%酒精2~5小時(可長期保存組織)80%酒精2~5小時90%酒精2~5小時95%酒精（Ⅰ）2~5小時95%酒精（Ⅱ）2~5小時無水酒精（Ⅰ）30分鐘無水酒精（Ⅱ）30分鐘無水酒精（Ⅲ）30分鐘（二）脫水步驟和時間以18mm×18mm，厚約2~3mm的組織塊為例，其脫水步驟和參考時間如下70%酒精2~33（三）脫水注意事項

1．組織脫水必須掌握由低濃度逐步過渡到高濃度的原則2．脫水時間要適度3．組織脫水要徹底干凈（三）脫水注意事項34四、透明（一）透明意義及透明劑組織脫水后，內部僅含脫水劑，但大多數脫水劑不能與石蠟相溶，石蠟仍不能浸入組織內進行包埋和切片。為此，需要一種既能溶于脫水劑又能溶于包埋劑（石蠟）的溶劑，以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。這一過程往往使組織呈半透明狀，故稱透明二甲苯為石蠟包埋法中最常用的透明劑；它透明能力強，但易使組織收縮、變脆，故組織塊的透明時間不宜太長，小組織塊以30分鐘為宜，較大組織塊適當延長但不超過2小時四、透明（一）透明意義及透明劑35（二）透明步驟和時間

為了減少組織塊過度收縮，往往在無水酒精之后，先經過酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入純二甲苯中透明步驟和時間大致如下1．無水酒精:二甲苯=1:120~30分鐘2．二甲苯（Ⅰ）20~30分鐘3．二甲苯（Ⅱ）20~30分鐘（二）透明步驟和時間36（三）透明注意事項二甲苯必須保持無水組織塊脫水過程要徹底（三）透明注意事項37五、浸蠟（一）浸蠟目的

浸蠟是將透明過的組織塊在熔化的石蠟中浸漬的過程。目的是用石蠟代替組織塊中的二甲苯，在隨后溫度下降中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊，以便切片機切片五、浸蠟（一）浸蠟目的38

第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點54℃以下)1小時第2杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃)1小時第3杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃)30分鐘整個浸蠟時間控制在3小時之內浸蠟在恒溫箱中進行，且恒溫箱溫度高于石蠟熔點2~3℃（二）浸蠟的步驟第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點54℃以下)39（三）浸蠟注意事項

1．浸蠟最佳溫度應是石蠟剛熔化、或蠟杯底部尚殘留小部分未熔完蠟時的溫度2．浸蠟中一般采用浸蠟籃浸蠟法，把組織塊和標簽一齊裝入分格籃內浸蠟3．石蠟應在加熱的條件下過濾除去雜質4．浸蠟用的石蠟要定期更換5．新石蠟應在使用前放在溫箱內熔化一次，使其中的揮發性物質蒸發6．包埋結束后應將熔蠟從溫箱內取出，以免石蠟無益地加溫熔化（三）浸蠟注意事項40常規石蠟制片HE染色技術ppt課件41六、包埋（石蠟包埋法）（一）包埋目的及包埋劑

包埋是將某些特殊的支持物質浸入到組織塊內部，利用支持物質的物理特性，將整個組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的較硬固態結構，以便切片機制備極薄切片石蠟是組織學切片技術中最常用的包埋劑六、包埋（石蠟包埋法）（一）包埋目的及包埋劑42（二）包埋過程1．取預熱包埋框及金屬板，搭成包埋模具2.迅速傾注少量熔蠟于包埋框中3.從蠟杯中夾取組織塊，切面向下置于框底4.加熔蠟至包埋框上緣，將標簽紙緊貼旁邊5.表面熔蠟凝結至一定厚度時，慢慢浸入冷水中（夏天用冰水）急速凝固6.凝結蠟塊自動漂浮于水面，或30分鐘后推開包埋框，取出蠟塊。7.修塊（二）包埋過程43常規石蠟制片HE染色技術ppt課件44（三）包埋注意事項

1．包埋蠟的熔點選擇2．石蠟脆性大時，可加蜂蠟提高韌性3．包埋用石蠟和最后浸蠟的石蠟熔點要相同4．包埋中組織塊間要有一定距離5．石蠟凝固要快速（三）包埋注意事項45常規石蠟制片HE染色技術ppt課件46七、切片（一）石蠟切片機及切片刀1．石蠟切片機最常用的石蠟切片機是輪轉式切片機，它的切片刀固定不動，而靠右側旋轉的重輪帶動螺紋軸和齒輪，將組織塊夾具按所調節的切片厚度向前推進，并在上下平面運動，讓組織塊經過前下方切片刀而切成一定厚度的切片七、切片（一）石蠟切片機及切片刀47常規石蠟制片HE染色技術ppt課件48

2．切片刀與磨刀石蠟切片常用的切片刀為平楔型切片刀，也有一次性切片刀非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其鋒利；研磨刀可分為手工研磨刀和機械研磨刀（磨刀機）兩種2．切片刀與磨刀49常規石蠟制片HE染色技術ppt課件50常規石蠟制片HE染色技術ppt課件51常規石蠟制片HE染色技術ppt課件52（二）石蠟切片過程1．修塊2．蠟塊和切片刀固定3．調整蠟塊切面和切片刀角度(10°以內)4.調整刀臺與標本臺距離5.修整蠟塊切面，暴露完整組織切面6.調整切片厚度調節器(厚度為6~8μm)7.正式切片8．切片展平9．貼片和烘片（二）石蠟切片過程53常規石蠟制片HE染色技術ppt課件54常規石蠟制片HE染色技術ppt課件55常規石蠟制片HE染色技術ppt課件56

（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時間長、浸蠟溫度高（2）蠟片卷曲：刀口不鋒利或臟、刀角傾斜過度、石蠟過硬（3）切片不成蠟帶：室溫低、石蠟過硬、蠟塊上下邊過小或不平（4）蠟帶彎曲：蠟塊的兩側大小不等、刀口不鋒利（5）切片皺褶：石蠟過軟、浸蠟不完全、刀的傾斜角度過小（6）切片厚薄不均：刀口不鋒利、切片機性能不佳、刀架或刀或蠟塊未固定牢（7）切片出現縱紋：刀刃有缺口、石蠟或組織的硬度不一（8）切片出現橫紋：蠟塊、刀或刀架未固定好（9）切片粘刀：刀鋒沾污、刀的傾斜角度過小、刀口不鋒利（10）蠟塊底邊呈白色：刀的傾斜角度過小（11）切片粘蠟塊：刀純、刀口不潔、室內溫度高、太干燥（三）切片過程中常遇問題及可能造成原因（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時間長、浸蠟溫度高（三57第三節蘇木素-伊紅染色方法染色是將組織浸入染料配制的染色液中，使組織中的不同結構染上不同顏色或不同深淺的顏色，從而產生不同的折射率，便于在光鏡下清楚地顯示組織內部各種構造第三節蘇木素-伊紅染色方法染58

染料是一類有色的以苯環為基礎的有機化合物，它不同于一般顏料，因為它不但有顏色，更重要的是它對組織的不同成份具有不同的親和力。構成染料至少必須有兩種原子團連接于苯環上，即能使染料顯色的原子團-發色團和能使染料對不同組織具有不同親和力及加深顏色的原子團（酸、堿性基團）-助色團染料是一類有色的以苯環為基礎的有機化59

分類

細胞核染料有天然染料蘇木素、胭脂紅及人工合成的染料結晶紫、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、焦油紫等

細胞質染料有人工合成的伊紅Y、酸性復紅、苦味酸、水溶性苯胺藍等分類60媒染劑為有些二價或三價金屬物質，如鋁、鐵、銅、鎢等可作為中介媒體物質，使原來幾乎不與組織結合或結合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）著色；它主要是通過增加染料對組織中某一成份的親和能力，自身又與染料或組織發生結合而發揮作用媒染劑為有些二價或三價金屬物質，如鋁61

助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強染料的染色能力，而自身不參與染色反應分化劑（脫色劑、分色劑）用于退行性染色法中脫去組織過染的染料，降低著色顏色

酸性分化劑0.5~1%的鹽酸酒精（95%以下）或較稀的冰醋酸水溶液

氧化分化劑苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、過錳酸鉀等

媒染分化劑既能促使組織和染料結合，又可使已經結合到組織上的染料脫離助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強染62一、蘇木素-伊紅染色的基本原理

蘇木素和伊紅染色是組織學中常規制片中最基本，也是應用最廣泛的染色方法，故稱常規染色（簡稱HE染色）

一、蘇木素-伊紅染色的基本原理蘇木素63

蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是較好的細胞核堿性染料，并可將細胞中不同的結構分化出各種不同的顏色；蘇木素分子須經氧化形成蘇木紅分子，才具有真正的染色能力；同時須配合適當的媒染劑以增強它對組織的親和力，達到染色目的

伊紅（或曙紅）是人工合成的煤焦油類染料，紅色粉末狀，易溶于水或酒精，為酸性細胞胞質染料；有伊紅Y、B、BN等，常用的是伊紅Y。伊紅常作為蘇木素的對比染色染料，染色中常需加助染劑和分化劑，使染色效果更加好

蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于64二、蘇木素-伊紅染液的配制（一）蘇木素染液一種是將氧化劑（如氧化汞、高錳酸鉀、過氧化氫或碘酸鈉等）與媒染劑（硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀或硫酸鋁鐵等）直接混合于蘇木素中配成溶液另一種是先用媒染劑媒染組織結構，再用氧化的蘇木素（自然氧化）染色，最后用媒染劑分色

二、蘇木素-伊紅染液的配制（一）蘇木素染液65Harris蘇木素染液蘇木素1g無水酒精10ml硫酸鋁鉀（或硫酸鋁銨）20g蒸餾水200ml氧化汞0.5gHarris蘇木素染液66Mayer蘇木素液蘇木素1g蒸餾水1000ml碘酸鈉0.2g硫酸鋁鉀50g枸櫞酸鈉1g水合氯醛50gMayer蘇木素液67醇溶性伊紅染液伊紅Y0.5g95%酒精100ml水溶性伊紅染液伊紅Y0.5-1g蒸餾水75ml95%酒精25ml冰醋酸1~2滴（二）伊紅染液醇溶性伊紅染液（二）伊紅染液68（三）分化液去除過度染色或不需要著色的組織成份上顏色的過程，叫分色所使用的試劑配制的液體稱為分化液而蘇木素的分化過程中，使酸性條件轉變成堿性條件，蘇木素染色的結構也由紅色轉變成藍色，所以這一過程又稱藍化

（三）分化液去除過度染色或不需要著色的組織成份上69

1．氫氧化銨水溶液（pH7.5-8.0）氫氧化銨（氨水）3ml蒸餾水1000ml2．1%鹽酸酒精溶液鹽酸1ml70%酒精99ml1．氫氧化銨水溶液（pH7.5-8.0）70三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、

脫水和透明等的作用

石蠟去石蠟去二甲苯水化顏色

二甲苯

酒精水染液透明

脫水水分二甲苯酒精三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、

脫水和透明等71四、染色程序

（一）脫蠟至水石蠟切片冰凍切片1．二甲苯（Ⅰ）5分鐘2．二甲苯（Ⅱ）5分鐘3．無水酒精（Ⅰ）5分鐘4．無水酒精（Ⅱ）5分鐘5．95%酒精5分鐘6．80%酒精1分鐘7．70%酒精1分鐘8．自來水2分鐘3分鐘9．蒸餾水1分鐘1分鐘四、染色程序（一）脫蠟至水72（二）染色石蠟切片冰凍切片1．蘇木素液5-15分鐘1-2分鐘2．自來水洗1分鐘30秒3．酸性分化液（鏡下控制）30秒20秒4．自來水藍化20分鐘20秒5．稀氨水30秒6.蒸餾水10秒20秒7．70%酒精3分鐘3分鐘8．80%酒精3分鐘3分鐘9．沉淀酸化伊