第7講:植物轉基因育種一、植物轉基因育種概述（一）植物轉基因育種概念

從供體生物中分離目的基因（或含目的基因的DNA片段）,經DNA重組與遺傳轉化或直接轉入受體植物，經過篩選獲得穩定遺傳與表達的遺傳工程體，并經田間選擇與試驗育成表現出目標性狀的植物新品種或種質資源的育種方式。

轉基因作物（GMcrops，GeneticallyModifiedcrops）

轉基因食品（GMfood，GeneticallyModifiedfood）（二）轉基因育種的優勢可打破物種界限，拓寬可利用的基因資源；為培育高產、優質、高抗品種提供新的育種途徑；可定向改良受體品種的個別目標性狀，但不改變其遺傳背景和既有性狀；大大提高選擇效率，加快育種進程;可將植物作為生物反應器生產藥物等生物制品。（三）轉基因育種的程序基因分離體外重組轉化轉化體安全性評價結合常規育種轉基因品系市場開發載體的構建農桿菌介導，基因槍轟擊,等篩選遺傳穩定性評價表達及表型鑒定轉基因品種區域試驗、品種審定（四）轉基因育種涉及的植物自1983年報道第一例轉基因煙草以來，至今已有200多種植物轉基因成功。已大面積推廣應用的轉基因作物主要包括：大豆(≈3/4)、棉花(≈4/5)

油菜(≈1/4)、玉米(≈1/3)（五）轉基因育種涉及的主要目標性狀抗（耐）除草劑抗蟲抗（耐）病：細菌、真菌、病毒、線蟲等病害抗（耐）非生物脅迫：干旱、水澇、鹽堿、極端氣溫、瘠薄土壤提高品質：蛋白、脂肪酸、淀粉、油脂、維生素等的組成及含量，耐儲藏性、休眠特性、花色，等提高產量：高光效、農藝性狀、經濟性狀雄性不育（六）全球轉基因植物育種進展全球轉基因作物交易額：2005年達60億美元；2010年達200億美元。截止2010年，先后有59個國家通過了964項安全管理認證，涉及的植物種類有24種；29個國家種植商品化轉基因植物；1540萬農民種植轉基因作物。(七)我國轉基因植物育種進展1992年中國首先在大田種植轉基因抗病毒煙草，揭開了全球轉基因作物商業化的序幕。至2012年，我國已研發獲得重要性狀基因300多個，其中46個具有自主知識產權。至2012年，我國已發放7種轉基因作物的安全證書：耐儲藏番茄、抗蟲棉、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、抗蟲水稻、轉植酸酶玉米（降解飼料中的植酸磷、釋放可被動物利用的無機磷、提高飼料利用效率，同時減少動物糞便中磷的排放）我國成為世界六大種植轉基因作物的國家之一，主要是轉基因抗蟲棉。

2010年我國轉基因棉花種植面積為349萬公頃，占總種植面積七成以上。二、植物轉化的受體系統及轉化方法（一）受體系統：指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其他非組織培養方法，產生高效穩定繁殖的無性系，并能接受外源DNA整合、對抗生素等選擇敏感的再生體系。愈傷組織再生系統原生質體再生系統生殖細胞受體系統胚狀體再生系統直接分化再生系統葉綠體再生系統

植物基因轉化的外植體建立植物轉化受體系統的主要考慮因素：具有穩定的外植體來源具有高效穩定的再生能力具有較好的遺傳穩定性對選擇性抗生素敏感對農桿菌侵染敏感；低成本（二）轉化方法1.農桿菌介導法(Agrobacterium-mediatedtransformationmethod)農桿菌介導法程序載體制備感受態制備共培養洗滌農桿菌分化成苗轉化子篩選工程菌制備煉苗移栽鑒定2.基因槍法：（genegun，microprojectilebombardment）利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅動力，將載有外源DNA的金粉（或鎢粉）等金屬微粒加速，射入受體細胞或組織，從而達到將外源DNA分子導入受體細胞的目的。發生士大夫受體細胞或組織的預處理DNA微彈的處理受體材料的轟擊過渡培養和篩選培養滲透壓調節甘露醇/山梨醇CaCl2、亞精氨、無水乙醇處理DNA+(金粉或鎢粉)3.花粉管通道法：(pollen-tubepathway)

利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源DNA導入植物的技術，為我國學者周光宇創立，1983年成功用此法將外源DNA導入棉花中?；驹恚菏诜酆笸庠碊NA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。操作方法:（1）柱頭切除法；（2）花粉粒吸入法；（3）柱頭涂抹法4.聚乙二醇法：（polyethyleneglycol,PEG）

利用PEG使細胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋，促使相互間接觸和粘連，并可通過改變細胞膜表面的電荷，引起細胞膜透性變化，從而促進外源大分子進入原生質體，然后恢復膜透性，進行培養分化。5.電擊法（electroporation）

又稱電穿孔法，利用高壓電脈沖作用使細胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進入細胞的轉化方法。6.顯微注射法（Microinjection）

利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細胞（如原生質體），并使其成活、增殖而發育成為轉基因個體。7.浸漬法：將葉片、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、懸浮細胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因導入受體細胞并得到整合與表達的一種轉化方式。基本原理：利用植物細胞自身的物質運轉系統，將外源DNA直接導入受體細胞。外源DNA分子進入細胞的途徑：①細胞間隙和胞間連絲途徑；②細胞的內吞作用；③細胞膜的透性常用植物基因轉化方法比較評價項目植物基因轉化的方法農桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法花粉管通道法受體材料完整細胞原生質體原生質體原生質體完整細胞卵細胞宿主范圍有無無無無有性繁殖植物組培條件簡單復雜復雜復雜簡單無轉化率較高較低較低較高較高較低嵌合體比例有無無無多無操作復雜性簡單簡單復雜復雜復雜簡單設備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴便宜轉化工效高低低低高低單子葉植物應用少可行可行可行廣泛廣泛三、外源基因的表達、檢測與遺傳特性

轉基因植物外源基因的表達及其調控外源基因的檢測轉基因植物的遺傳特性（一）轉基因植物外源基因的表達及其調控轉基因沉默現象：外源目的基因在轉化植株內存在，但其表達水平很低，甚至不表達的現象。按其發生的階段可分為轉錄沉默和轉錄后沉默。轉基因沉默機理包括DNA甲基化、多拷貝整合、位置效應、后成修飾作用等。提高外源基因表達水平的策略

強啟動子的選擇和改造；利用增強子序列；利用真核基因的調控序列；利用定位信號提高外源基因表達產物的含量；葉綠體轉化（基因拷貝數多）

（二）外源基因的檢測

轉基因植物應符合的條件及證據：①要有嚴格的對照（陽性、陰性）；②轉化當代要提供外源基因整合和表達的分子生物學證據，物理數據（PCR，Southern雜交，Northern雜交，Western雜交等）與表型數據（酶活性分析等）；③提供外源基因控制的表型性狀證據（抗蟲、抗病等）；④根據該植物的繁殖方式（有性或無性）提供遺傳證據：有性繁殖植物需要目的基因控制的表型性狀傳遞給后代的證據；無性繁殖植物要有在繁殖后代中穩定遺傳的證據。

報告基因的表達檢測：

1、Gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）

2、NPT-Ⅱ基因（新霉素磷酸轉移酶基因）

3、GFP/RFP基因（綠色/紅色熒光蛋白基因）

4、冠癭堿合成酶基因（胭脂堿、章魚堿）

5、cat基因（氯霉素乙酰轉移酶基因）

6、pat基因（抗除草劑基因）

7、潮霉素抗性基因外源目的基因的檢測外源基因的整合的Sourthern檢測外源基因的轉錄的Northern檢測外源基因表達蛋白的酶聯免疫吸附法（

ELISA)和WesternBlotting檢測外源基因整合和表達的原位雜交檢測轉基因植物的PCR檢測外源基因整合和表達的其他分析方法

RFLP,RAPD,整合位點遺傳分析,生物芯片分析（三）轉基因植物的遺傳特性外源基因的整合特性

整合位點隨機性；

整合拷貝數：單拷貝單位點插入，串聯拷貝單位點插入，多拷貝多位點插入；

外源基因整合的遺傳效應

位置效應：整合位點不同，表達效率也不同；

重組效應：正效應、負效應和無影響的狀態；外源基因的遺傳特性

T1代為雜合等位基因，T2代開始分離與純合孟德爾式遺傳：單位點插入符合單基因分離規律；多位點插入符合獨立分離規律；

非孟德爾式遺傳：轉基因丟失；轉基因沉默；花粉致死；誘發隱性致死突變或轉基因純合致死四、轉基因生物安全性評價與管理

轉基因生物的安全性問題至今仍在全球范圍內存在激烈的爭論。反對者認為轉基因生物具有極大的潛在危險，可能會對人類健康和生態環境造成威脅。在歐洲，轉基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”。（一）國際上幾個關于轉基因作物及食品安全性的爭議事件：Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉基因作物試驗地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗田，甚至美國加州大學戴維斯分校的非轉基因試驗材料也遭破壞，以致研究生畢業論文都無法如期完成。英國皇家學會組織了同行評審，并于1999年５月發表評論，指出Pusztai的試驗有六方面的錯誤：不能確定轉基因和非轉基因馬鈴薯的化學成分有差異；對食用轉基因土豆的大鼠，未補充蛋白質以防止饑餓；供試動物數量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標準食物，缺少統計學意義；試驗設計差；統計方法不當；試驗結果無一致性等。君主斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學的一個研究組在《Nature》雜志上發表文章，聲稱轉基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導致44％的幼蟲死亡。但是2000年開始在美國三個州和加拿大進行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構成威脅，實驗室試驗中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發現對其生長發育有影響。

斑蝶減少的真正原因，一是農藥的過度使用，二是墨西哥生態環境的破壞。

加拿大“超級雜草”事件

由于基因漂流，在加拿大油菜地里發現了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并怪罪于轉基因。

基因漂流并不是從轉基因作物開始。如果沒有基因漂流，就不會有進化，世界上也就不會有這么多種的植物和現在的作物栽培品種。中國抗蟲棉破壞環境事件：

2002年6月3日，南京環科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《Chinadaily》上發表了題為“GMCottonDamageEnviroment”的文章。當天,綠色和平組織在其網站上刊登了長達26頁的英文報告，從而再次引發國際爭論，在歐、美產生巨大反響。６月５日德國《農業報》發表了題為“中國研究Ｂｔ棉破壞環境巨大”。綠色和平組織的“中國項目主管”聲稱：“棉農將面對不受控制的超級害蟲”、“轉基因抗蟲棉不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”、“棉農將被迫使用更多、更毒的農藥”。

事實上，抗蟲棉在中國實踐多年，深受廣大棉農的歡迎。中國、美國、德國、加拿大、比利時、印度等國的科學家已在網上紛紛發表評論，反駁綠色和平組織的觀點。

湖北非法銷售轉基因水稻種子事件

2005年綠色和平組織在湖北發現非法銷售和種植的轉基因水稻“Bt汕優63”種子，由此生產的大米已進入市場，擔心威脅到消費者的健康和生態環境。

事實上，至今沒有任何證據或相關報道證明轉基因大米有害。爭論的背后實質

：

現在轉基因作物的安全性已經成了國際貿易的技術壁壘。由于某些媒體的炒作，對消費者的心理和轉基因作物的產業化已經產生了很大的負面影響。

我們的判斷？

（二）轉基因植物的安全性評價（風險評估）1.轉基因植物食品的安全性評價（1）評價內容

毒性：必須確保轉入的外源基因及其產品對人畜無毒。

過敏源：如果有過敏源形成基因轉入植物中，可能會對過敏人群造成不利的影響。

抗生素抗性標記基因：目前尚無足夠證據表明此類基因安全或不安全，因此提倡無標記（marker-free）轉基因產品。（2）評價原則

實質等同原則：轉基因食品是否與市場上銷售的對于食品具有實質等同性（成分、含量等）

預先防范性原則：轉基因植物