BRCA1蛋白在胰腺癌組織中的分布和表達

作者：王春楊，張金山，張遠強，孫圣坤，蔡偉，高江平，洪寶發，王曉雄，王紅

【摘要】目的：研究腫瘤抑制基因BRCA1對胰腺癌的作用和其蛋白在胰腺癌組織中的分布和腫瘤發生中的蛋白特性.方法：以乳腺癌的細胞株作為陽性對照組，對胰腺癌組織中的BRCA1亞細胞分布做了免疫熒光雙重染色，免疫組織化學等實驗并進行量化.結果：BRCA1蛋白在胰腺癌的組織中呈一定比例分布，這點在不同的胰腺癌患者組織標本中得到證實.免疫熒光雙重染色法證實BRCA1蛋白在胰腺癌細胞胞質和胞核間互動，這是國內首次發現和報道BRCA1在胰腺癌組織細胞中胞質和胞核間互動現象和其亞細胞分布情況.結論：我們的多病例研究結果都證實BRCA1的胞質胞核有比例明確分布，提示可能是參與胰腺癌組織中蛋白功能調節機制，并可能具有與胰腺癌發生相關的蛋白特性，在胰腺癌細胞其亞細胞分布現象預示著將有更好的胰腺癌臨床治療的生物靶點.

【關鍵詞】胰腺腫瘤；BRCA1；組織；出核

【Abstract】AIM：ToinvestigateBRCA1distributioninpancreaticcancertissueanditsproteincharactersinthedevelopmentofcancer.METHODS：UsingthehumanbreastcancercelllineMCF7aspositivecontrol,thesubcellulardistributionofBRCA1wasinvestigatedinpancreaticcancertissuebydoubleimmunofluorescencestainingandimmunohistochemistry.RESULTS：BRCA1wasdistributedindifferentpancreaticcancertissues.DoubleimmunofluorescencestainingrevealedthattheinteractionofBRCA1proteinbetweencellplasmandnucleusstimulatedBRCA1nuclearexportwasobviousindifferentpancreatictissues.BRCA1nuclearcytoplasmicshuttlingmannerwascorrelatedwithcancerdevelopment.CONCLUSION:DistributionofBRCA1inplasmandnucleusofpancreaticcancercellsindicatesthatitmaybeinvolvedinproteinfunctionregulationofpacreaticcancertissue,possessthecharactersofproteinsrelatedtocancerdevelopment,andbecomeabetterbiologicaltargetfortheclincaltherapyofpancreaticcancer.

【Keywords】pancreaticneoplasms;BRCA1;tissues;nuclearexport

0引言

近年來研究表明，BRCA1的背景是乳腺癌相關蛋白，其基因是腫瘤抑制基因之一.BRCA1蛋白由1863個氨基酸組成，有N端、C端和中間ATM,ATR的磷酸化區組成.如果有BRCA1基因突變的患者直到70歲前其乳腺癌的發病率85%左右，這比普通人群遠遠高出20倍.許多高度散發型乳腺癌和卵巢癌的病例也有BRCA1蛋白表達明顯降低的現象，許多研究已經提示了其在散發型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用［1］；但BRCA1在胰腺癌組織的分布及其作用近年鮮有報道.很多證據證實BRCA1在許多細胞過程中是非常必須的：如DNA修復,細胞周期，checkpointcontrol,轉錄調節和凋亡，直到染色體重建［2-5］,但是其腫瘤抑制功能中的作用機制有待進一步研究，尤其是在胰腺腫瘤等與激素有關的腫瘤中BRCA1特性蛋白和導致腫瘤發生的原因需要進一步研究，我們對BRCA1蛋白在胰腺癌的分布和特性以及可能有關機制進行了研究和討論.

1材料和方法

材料

解放軍總醫院確診胰腺癌病例石蠟包埋標本20例，第四軍醫大學組胚教研室胰腺癌病例石蠟包埋存檔標本15例.熒光顯微鏡，小鼠抗人BRCA1mAb,FITC標記的和AvidinTexasred標記的第2抗體和蘇木精和伊紅染料.

方法

組織切片制備胰腺癌組織切成4mm×5mm的方塊，經40g/L多聚甲醛固定(含苦味酸)后梯度脫水、浸蠟過夜高溫包埋.石蠟切片機進行切片，成5μm石蠟切片，經貼片、脫蠟、復水等過程后準備做抗體染色或HE染色.

免疫熒光雙重染色和免疫熒光顯微鏡觀察細胞陽性對照操作：消毒無菌的蓋玻片無菌操作在潔凈臺下用鑷子放在6孔板中，g/L的胰酶消化后的MCF7用DMEM培養液懸浮后分裝到6孔板中，每孔細胞數量2×105，細胞貼壁后24h置入-20℃,700mL/L乙醇中固定10min，pH值~的mol/LPBS沖洗充分后與準備好的組織切片成套以20mL/LBSA封閉1h，浸潤BRCA1第一抗體4℃過夜.第二抗體FITC羊抗小鼠或者第二抗體AvidinTexasred山羊抗小鼠室溫搖動充分浸潤4h.pH值~的mol/LPBS沖洗3遍，最后以DAPI復染10min，熒光封片劑封片待觀察計數。每組實驗重復進行3次.顯微鏡觀察時每個病例取5組切片，每張切片讀取10個高倍視野約500個腫瘤細胞.

染色選擇相鄰組織切片經貼片、脫蠟、復水的胰腺癌病例組織切片后，再經蘇木精染色10min，常規梯度脫水，800mL/L乙醇脫水后經伊紅染色1min，依次經900,1000mL/L乙醇脫水、二甲苯透明，封片劑封片待觀察以確定顯微鏡下腫瘤組織和細胞.

統計學處理:所有數據均采用x±s表示，組間比較采用t檢驗，為差異有統計學意義.

2結果

蛋白在人胰腺癌組織的表達免疫熒光染色實驗和熒光顯微鏡的形態學觀察結果證實胰腺癌存在BRCA1蛋白表達，作為陽性對照的人類乳腺癌系細胞株有85%以上的細胞表達BRCA1，35例胰腺癌組織有40%的細胞表達BRCA1，且其中有25%蛋白在細胞核分布,40%胞核、胞質同時存在，35%只在胞質中存在BRCA1蛋白.免疫熒光顯微鏡觀察到細胞表達BRCA1以中等強度的AvidinTexasred或FITC熒光信號為標準.

蛋白在不同胰腺癌患者標本的分布BRCA1蛋白出核現象在一些病例非常明確，BRCA1的組織分布有核質比例改變，甚至BRCA1蛋白在細胞核沒有分布，僅在細胞質可以觀察到BRCA1的分布，這樣的病例有14個包埋標本，比例是40%左右.對于大多數胰腺癌患者的組織切片BRCA1蛋白在細胞核和質的細胞分布比例是均勻的，這部分病例組織中BRCA1蛋白分布在細胞質和細胞核占45%~53%，BRCA1蛋白在細胞質的細胞分布比例由31%到47%.

3討論

BRCA1是腫瘤抑制基因之一，BRCA1是乳腺癌、卵巢癌相關蛋白，在前列腺癌和結腸腫瘤等眾多腫瘤中存在；由1863個氨基酸組成，有N端、C端和中間ATM,ATR的磷酸化區組成.在對DNA損傷的細胞性反應中有許多重要關鍵作用.近年來有關文章報道BRCA1在乳腺腫瘤細胞的分布很明確［6-7］，并在DNA修復，細胞周期，轉錄調節和細胞凋亡等功能中有相應的重要作用，但是關于BRCA1在胰腺腫瘤的分布和相關功能報道很少，本研究的創新性就在于首次以免疫組織化學和免疫熒光雙重標記等方法證實了BRCA1蛋白在胰腺癌細胞存在，提出了BRCA1與乳腺癌，卵巢癌、結腸癌以外還與另一種激素相關的腺體腫瘤胰腺癌相關.

BRCA1蛋白功能的許多方面都需要其有細胞核分布，例如DNA修復、轉錄調節和細胞周期checkpoint控制。最近的研究表明BRCA1蛋白是一種細胞核、細胞質的互動蛋白［8］.尤其是在乳腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞中照射后其出核現象和功能的討論有很多相關報道［9-10］.但是關于其真正的出核機制研究卻不是特別清楚.本研究還通過免疫熒光雙重染色法結果明確表明胰腺癌的BRCA1蛋白表達也有細胞核、細胞漿的互動現象，并且和以往關于其他腫瘤的研究不同，BRCA1蛋白表達在細胞質和核同時存在的比例非常高.我們的研究證實BRCA1蛋白在胰腺癌細胞胞質和胞核間互動現象，這是國內首次發現和報道BRCA1在胰腺癌組織細胞中胞質和胞核間互動現象和其亞細胞分布情況.

本研究重點發現了胰腺癌組織的BRCA1蛋白表達，而且與BRCA1在乳腺和卵巢癌細胞株也是胞質胞核互動性蛋白的觀點也一致，但發生BRCA1蛋白的核質比例改變在胰腺癌組織很特殊，并且與腫瘤發生發展機制和功能可能有密切關系.在胰腺癌細胞其亞細胞分布現象提出了科學研究下一步問題，而明確在胰腺癌組織細胞BRCA1蛋白的出核現象，有助于將來對他們進一步檢測和判定其與胰腺癌的惡性程度和進程相關性，也可能為將來引用新的生物治療胰腺癌辦法提供新的思路.

綜上所述，我們得出以下結論：①胰腺癌組織細胞中明確存在BRCA1蛋白表達，其正常分布比例為細胞核占25%，細胞核與質占40%；細胞質占35%。提示可能是參與胰腺癌組織中蛋白功能調節機制;②其質核分布比例在不同的病例各有特點,即BRCA1在胰腺癌組織有蛋白出核現象，從而核質比例改變，進一步提示BRCA1可能具有與胰腺癌的發生相關的蛋白特性;③BRCA1出核現象可能與DNA修復功能以及與腫瘤惡性程度相關，也提示是好的臨床治療靶點.

【參考文獻】

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［5］VenkitaramanAR.CancersusceptibilityandthefunctionsofBRCA1andBRCA2［J］.CellGrowthDiffer,2002,108:171-182.

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［8］RodriguezJA,HendersonBR.IdentificationofafunctionalnuclearexportsequenceinBRCA1［J］.JBiolChem,2000,275:38589-38596.

［9］FengZH,KachnicL,ZhangJR,etal.DNAdamageinducesp53depend