核酸分子雜交演示文稿1當前第1頁\共有167頁\編于星期五\10點核酸分子雜交當前第2頁\共有167頁\編于星期五\10點3（一）“戴帽安尾（穿靴）”（核內）——5加帽和多聚腺苷酸化及其調控意義

1.mRNAcaping→5’加上GpppmNP帽子，tailing→加上AA···（50~200bp）尾巴。

意義（1）保護作用—保護mRNA免受核酸酶降解，（2）標識作用—為翻譯提供識別位點（CBP）。

2.rRNA不易被降解的機理可能是因為其組成核糖體是在核內組裝的。

3.tRNA合成后形成特殊的空間結構（三葉草，倒L），可能抵抗降解，半壽期長。當前第3頁\共有167頁\編于星期五\10點4當前第4頁\共有167頁\編于星期五\10點5hnRNA內含子剪接位點的堿基順序具有最強的保守性

5'GT——AG3'當前第5頁\共有167頁\編于星期五\10點6（二）mRNA的選擇剪接對基因表達的調控作用

1.mRNA的選擇剪接有多種方式選擇剪接方式要點（1）外顯子選擇Optionexon或稱外顯子跳躍（exonskipping）→全部保留或至少刪除1個或幾個外顯子。（2）內含子選擇Optionintron→內含子全部刪除保留1個（近來也有內含子表達的報道）。（3）互斥外顯子Mutuallyexclusiveexon→2個外顯互斥→在同1個成熟mRNA只出現1個。（4）內部剪接位點Internalsplicesite→通過剪接供點或受點選擇決定選擇或剪切。m7Gpppm7GpppintronexonexonAAA···AAA···P259當前第6頁\共有167頁\編于星期五\10點7當前第7頁\共有167頁\編于星期五\10點82.可變剪接的調控機制⑴SR蛋白家族的調控剪接體的形成與多種蛋白質和RNA復合體密切相關。在可變剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的參與起重要作用。SR蛋白家族以不同的質的組成與量的差異選擇特定的mRNA前體剪接位點，不同的SR家族蛋白對適當的mRNA前體可以誘導出不同選擇的剪接方式，在選擇剪接上起決定作用。當前第8頁\共有167頁\編于星期五\10點9⑵RNP的調節hnRNP-A1在不同組織中的含量變化很大，不參與組成性剪接。在選擇5’和3’剪接點時具有可變剪接活性，成為參與可變剪接的調節因子，在體內與SR蛋白共同調節組織特異性的剪接。U5hnRNP在酵母中參與5’剪接點突變的可變剪接。當前第9頁\共有167頁\編于星期五\10點10⑶

外顯子限定模型真核細胞mRNA前體中內含子遠遠大于外顯子，5’與3’剪接位點可以跨越數萬個核苷酸準確地組合在剪接體中。有證據表明，在前速激肽原mRNA前體的可變剪接中，外顯子下游的5’剪接位點可影響其上游內含子3’的剪接。當前第10頁\共有167頁\編于星期五\10點11選擇剪接對基因表達的調控作用（實例）（1）Bax基因轉錄產物的選擇剪接

Bax基因編碼產物是與細胞凋亡有關的分子，（Bax/Bcl2↑調亡↑）

Bax編碼產生的Pr.有幾種（α、β、γ等），結構略有差異，差異的產生來自mRNA的選擇性剪接。①Baxα→保留全部（6個）外顯子→共192個密碼子→譯出192AA多肽②Baxβ→保留全部外顯子和第5個內含子（含終止碼）→共218個密碼子。③Baxγ→保留1、3、4、5、6外顯子，刪除第2個外顯子→譯出151AA多肽。當前第11頁\共有167頁\編于星期五\10點12（2）選擇剪接產生的IκBr①NF-κB是非廣泛存在的方式作用因子→可與基因上游啟動子元件或增加子內部的κB元件結合而→調節基因表達。②NF-κB與IκBr結合時→以無活性NFκB/IκBr復合體（105KD）→存在于胞漿③IκBr基因表達時→通過選擇剪接→刪除其mRNA中的178個或67個密碼子→閱讀框移動→產生2種具有新C端Pr.異構體→即IκBr1和IκBr2→2者缺失了1個蛋白激酶A位→該位點磷酸化調節IκBr活性。④剪接產生IκBr異構體→有可能使NF-κB對胞內作出不同響應，尚在研究中。當前第12頁\共有167頁\編于星期五\10點13當前第13頁\共有167頁\編于星期五\10點14（三）RNA編輯RNA編輯（RNAediting）是在RNA分子上出現的一種修飾現象。主要指mRNA在轉錄后因插入、缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質。RNA編輯似乎是中心法則的例外。編輯擴大了遺傳信息，也可能是生物適應的一種保護措施。P260當前第14頁\共有167頁\編于星期五\10點151.核苷酸的替換⑴

Ｃ→U替換最典型的例子是載脂蛋白B的RNA編輯。Ｃ→U替換使Apo-B100CAA編碼的谷氨酰胺突變為UAA的終止密碼子，產生編碼Apo-B48的mRNA。在蛋白質水平上只保留了Apo-B100分子N端脂蛋白裝配結構域，缺少了C端低密度脂蛋白受體結合區。當前第15頁\共有167頁\編于星期五\10點16當前第16頁\共有167頁\編于星期五\10點17⑵

A→I替換在β珠蛋白、c-Myc、成纖維細胞生長因子基因中都有因A→I替換使互補鏈的U被RNA酶A水解的現象。當前第17頁\共有167頁\編于星期五\10點182.可讀框的改變可讀框的改變主要是核苷酸的插入或缺失。G或C的插入則往往是因為模板上連續幾個C（或G）之后，互補鏈因一種滑動力而被添加到RNA中。當前第18頁\共有167頁\編于星期五\10點19當前第19頁\共有167頁\編于星期五\10點20當前第20頁\共有167頁\編于星期五\10點213.向導RNA向導RNA（gRNA）是一種線粒體內轉錄的短RNA（約55～70核苷酸），能以正常堿基配對或GU配對的方式，選擇其5’末端“錨區”在mRNA上的互補序列，為隨后插入或缺失U提供模板。當前第21頁\共有167頁\編于星期五\10點22當前第22頁\共有167頁\編于星期五\10點23當前第23頁\共有167頁\編于星期五\10點24（四）mRNA運輸的調控→mRNA運輸是受控制的。1.3H-udR顯示約20%mRNA→胞漿，核內RNA約在1小時內降解成→小片段2.核孔9nm，但可運輸>9nm顆粒（如核糖體15nm，在核內組裝→入胞作用）

用20nm金顆粒（goldsphere）包裝小RNA（如tRNA或5sRNA）→注射到蛙卵（frogoocyte）→可迅速過核孔到→胞漿。但注射入漿→則不能入核說明mRNA主動運輸入胞，但機制不清楚。P261當前第24頁\共有167頁\編于星期五\10點25翻譯起始的調控未受精卵：隱蔽mRNA(maskedmRNA)；受精：招募因子(recruitmentfactor)，激活隱蔽mRNA阻遏蛋白的調控：鐵結合調節蛋白(regulatoryiron-bindingprotein)翻譯起始因子的調控：eIF-2，血紅素對珠蛋白合成的調節5′AUG對翻譯的調控作用：減少正常AUG啟動翻譯的作用，使翻譯維持在較低水平mRNA5′端非編碼區長度對翻譯的影響翻譯水平的調控當前第25頁\共有167頁\編于星期五\10點26翻譯水平的調控原核生物mRNA的半衰期很短，在翻譯水平上的調控對于基因表達的影響也很小。mRNA的二級結構控制著翻譯的起始，核糖體蛋白的自體控制對蛋白質的合成起抑制作用。真核生物mRNA的半衰期比原核生物長的多，因此翻譯過程受調控的機會也較多。當前第26頁\共有167頁\編于星期五\10點27翻譯水平的調控是真核生物基因表達多級調控的重要環節之一。真核生物翻譯水平調控最普遍的機制是起始因子的磷酸化。蛋白質合成裝置各元件裝配活力的改變是導致蛋白質翻譯速率變化的主要因素。翻譯的速度和細胞生長的速度是密切協調的。當前第27頁\共有167頁\編于星期五\10點28一、翻譯因子磷酸化調控蛋白質合成因子的磷酸化狀態與其對蛋白質生物合成的激活或抑制作用密切相關。1．eIF-4F通過亞單位的可逆磷酸化對蛋白質生物合成進行調控。eIF-4E(α)和eIF-4G(γ/P220)亞基的磷酸化對蛋白質的生物合成有激活作用。當前第28頁\共有167頁\編于星期五\10點29當前第29頁\共有167頁\編于星期五\10點302．其他因子磷酸化對翻譯的激活作用eIF-4B在促有絲分裂劑作用下，隨eIF-4F和核糖體蛋白S6一起，在細胞內被磷酸化，激活起始因子eIF-4A和eIf-4B的活性。3．eIF-2的磷酸化對翻譯的抑制作用eIF-2α亞基的磷酸化會導致eIF-2與eIF-2B緊密結合，直接影響了eIF-2的再利用，引起翻譯起始作用受阻，從而抑制蛋白質的生物合成。當前第30頁\共有167頁\編于星期五\10點31阻遏Pr.的調控作用進入胞漿并非所有的mRNA分子→立即與核糖體結合→翻譯成Pr.

一些特定的翻譯抑制Pr.→可結合到mRNA5’,抑制翻譯。如：鐵Pr.（ferritin）mRNA5’端非編碼區約30個核甘酸序列稱為鐵反應元件（iron-responseelement）→可折疊成1個莖環（發夾結構）→可結合1個鐵結合調節蛋白（regulatoryiron-bindingpro）。當前第31頁\共有167頁\編于星期五\10點323′3′（1）有鐵→不抑制，快譯運輸工具。（2）無鐵結合可運→鐵結合Pr.結合mRNA→抑制翻譯。鐵結合調節蛋白當前第32頁\共有167頁\編于星期五\10點33Met40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6①elF-3②ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B，PAB③MetMet-tRNAiMet—elF-2—GTP真核生物肽鏈合成起始過程60S40SMetGDP+Pi各種elF釋放elF-5④Met80S起始復合物當前第33頁\共有167頁\編于星期五\10點34當前第34頁\共有167頁\編于星期五\10點35當前第35頁\共有167頁\編于星期五\10點36翻譯起始因子(eIF2)的調控當前第36頁\共有167頁\編于星期五\10點37(2)翻譯起始因子調節蛋白質合成的速度無活性的elF-2

elF-2有活性的elF-2P

P

PPP當前第37頁\共有167頁\編于星期五\10點385’-AuG對翻譯的調控作用（1）按Pr.生物合成模型，90%真核mRNA符合第1AUG規律→譯出正常Pr.（2）5’AUG可以減少正常AUG翻譯起始作用→使翻譯維持在較低水平。原癌基因中是控制原癌基因表達的重要因素→缺失→導致某些原癌基因翻譯激活。5’-AUG(1個或數個)第1-AUG非編碼區非正常開放閱讀框編碼區正常開放閱讀框5’3’mRNA當前第38頁\共有167頁\編于星期五\10點39mRNA穩定性調節3′端非編碼區結構影響其穩定性：3′端富含A和U的結構，引起mRNA不穩定蠶蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蠶絲蛋白，mRNA半衰期達100小時，其他僅2.5小時翻譯水平的調控當前第39頁\共有167頁\編于星期五\10點40mRNA降解的機制當前第40頁\共有167頁\編于星期五\10點41小分子RNA（lin-4）對翻譯水平影響Lin-14核Pr.調控生長發育的時間選擇Lin-4產生2個小分子RNA：1個長度22個核苷酸，另1個在3’端延長至40個核苷酸Lin-4RNA結合→Lin14mRNA3’UTR中的特異順序→去掉這種順序→mRNA就不會被抑制翻譯。小分子RNA對翻譯水平的影響當前第41頁\共有167頁\編于星期五\10點42新生肽鏈的水解：酶解肽鏈N端的第一個氨基酸：穩定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）與去穩定氨基酸肽鏈中氨基酸的共價修飾：磷酸化、甲基化、酰基化通過信號肽(signalpeptide)分揀、運輸、定位翻譯后水平的調控當前第42頁\共有167頁\編于星期五\10點43蛋白質合成后的靶向輸送（proteintargeting）

蛋白質合成后的去向留在胞漿進入核、線粒體或其它細胞器分泌至體液，輸送至靶器官靶向輸送--蛋白質合成后，定向地到達其執行功能的目標地點當前第43頁\共有167頁\編于星期五\10點44分泌性蛋白質(secretoryproteins)穿過合成所在的細胞到其它組織細胞去的蛋白質信號肽(signalpeptide)N-端的一段疏水氨基酸

10～40個氨基酸把合成的蛋白質移向胞膜并與胞膜結合，然后把合成的蛋白質送出胞外N-N端堿性疏水核心區

加工區-C

堿性氨基酸

極性和小側鏈氨基酸分泌蛋白當前第44頁\共有167頁\編于星期五\10點45分泌性蛋白質轉運的機制SRP:signalrecognitionparticles當前第45頁\共有167頁\編于星期五\10點46信號肽識別顆粒信號肽(signalpeptide)當前第46頁\共有167頁\編于星期五\10點47外膜轉運體內膜轉運體線粒體蛋白的靶向輸送當前第47頁\共有167頁\編于星期五\10點48細胞核蛋白的靶向輸送當前第48頁\共有167頁\編于星期五\10點49分子生物學

MolecularBiology核酸的分子雜交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology當前第49頁\共有167頁\編于星期五\10點50

堿基核苷核苷酸RNA

腺嘌呤（A）腺苷腺苷酸(AMP)

鳥嘌呤（G）鳥苷鳥苷酸(GMP)

胞嘧啶（C）胞苷胞苷酸(CMP)

尿嘧啶（U）尿苷尿苷酸(UMP)DNA

腺嘌呤（A）脫氧腺苷脫氧腺苷酸(dAMP)

鳥嘌呤（G）脫氧鳥苷脫氧鳥苷酸(dGMP)

胞嘧啶（C）脫氧胞苷脫氧胞苷酸(dCMP)

胸腺嘧啶（T）脫氧胸苷脫氧胸苷酸(dTMP)DNA和RNA的堿基﹑核苷和相應的核苷酸當前第50頁\共有167頁\編于星期五\10點51核苷酸之間連接當前第51頁\共有167頁\編于星期五\10點52

DNA雙螺旋結構當前第52頁\共有167頁\編于星期五\10點53BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).當前第53頁\共有167頁\編于星期五\10點54ContentofTable一、核酸分子雜交技術的原理二、核酸探針的制備三、核酸探針的標記四、核酸分子雜交技術五、DNA芯片技術當前第54頁\共有167頁\編于星期五\10點55一、核酸分子雜交技術的原理

有互補特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應同源區段將會退火形成雙鏈結構。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標記物（如放射性同位素、生物素等）予以標記，當作探針（probe),

與變性后的單鏈基因組DNA或RNA等進行雜交。用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學等技術）把標記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數及表達豐度等。

當前第55頁\共有167頁\編于星期五\10點56當前第56頁\共有167頁\編于星期五\10點57當前第57頁\共有167頁\編于星期五\10點58DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構象和性質發生改變。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。當前第58頁\共有167頁\編于星期五\10點59溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構，變性后代之以柔軟而松散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。溶液旋光性發生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變，使DNA溶液的旋光性發生變化。增色效應。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。在DNA雙螺旋結構中堿基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產生增色效應。當前第59頁\共有167頁\編于星期五\10點60復性指變性DNA在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性,此過程稱之為"退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。當前第60頁\共有167頁\編于星期五\10點61

應用：1）檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；2）用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數及表達豐度。當前第61頁\共有167頁\編于星期五\10點62影響雜交的因素核酸分子的濃度和長度溫度離子強度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復雜性非特異性雜交反應當前第62頁\共有167頁\編于星期五\10點63

1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復性速度越快分子越大，復性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg，濃度過高影響雜交效率當前第63頁\共有167頁\編于星期五\10點642、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低

20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm

值低5℃當前第64頁\共有167頁\編于星期五\10點653、離子強度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

當前第65頁\共有167頁\編于星期五\10點664、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交當前第66頁\共有167頁\編于星期五\10點675、核酸分子的復雜性：（1）核酸的復雜性是指存在于反應體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應體系中核酸復雜性成正比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復雜性當前第67頁\共有167頁\編于星期五\10點686、非特異性雜交反應：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉當前第68頁\共有167頁\編于星期五\10點69常用于預雜交的封閉物變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區域外，它們可被吸附到所有其它區域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在交雜反應中可大大減少探針的非特異性結合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點的能力。一般常用小牛血清白蛋白。Home當前第69頁\共有167頁\編于星期五\10點70二、核酸探針的制備探針（Probe):

一段帶有檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。當前第70頁\共有167頁\編于星期五\10點71理想的探針1.要加以標記、帶有示蹤物，便于雜交后檢測和鑒定雜交分子。2.應是單鏈，若為雙鏈用前需要先行變性為單鏈。3.具有高度特異性，只與靶核酸序列雜交，不與樣本中存在的其它核酸雜交。4.探針長度一般是十幾個堿基不等，小片段探針較大片段探針雜交速率快。5.作為探針的核苷酸序列要選取基因編碼序列，避免用內含子及其它非編碼序列。6.標記的探針應具有高靈敏度、穩定，標記方法簡便、安全。當前第71頁\共有167頁\編于星期五\10點72(一）探針的分類據制備方法及核酸性質不同，可分為：

基因組DNA探針（genomicprobe）

cDNA探針（cDNAprobe）

RNA探針（RNAprobe）寡核苷酸探針（oligonucleotideprobe)據探針標記物的類型不同：同位素標記的探針非同位素標記的探針當前第72頁\共有167頁\編于星期五\10點731、Genomicprobe

從基因組文庫中篩選和純化獲得的一個特定基因（或基因片段）的克隆片段。多為某一基因的全部或部分序列（含有內含子序列），或某一非編碼序列，或某一外顯子序列。當前第73頁\共有167頁\編于星期五\10點74①這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記。特點：當前第74頁\共有167頁\編于星期五\10點75

cDNA（complementaryDNA）是指互補于mRNA的DNA分子。這種DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。2、cDNAprobe當前第75頁\共有167頁\編于星期五\10點76

采用基因克隆或體外轉錄的方法獲得。有些病毒的基因組是RNA，分離后經適當標記可制成RNA探針。3、RNAprobe當前第76頁\共有167頁\編于星期五\10點77RNA探針優勢雜交的效率高，雜交體較穩定。RNA中不存在高度重復序列，因此非特異性雜交較少。雜交后RNase將未雜交的探針分子消化掉，使本底降低。當前第77頁\共有167頁\編于星期五\10點78

寡核苷酸探針是采用DNA合成儀人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。一般長度為20～50個堿基。亦可根據蛋白質氨基酸序列推導出核酸順序加以人工合成。4、oligonucleotideprobe當前第78頁\共有167頁\編于星期五\10點79探針的制備方法探針長度一般以50~300bp為宜。制備方法：1）利用DNA重組技術（基因組DNA探針制備）2）PCR擴增（cDNA探針制備）3）化學合成（寡核苷酸探針制備）當前第79頁\共有167頁\編于星期五\10點80制備基因組文庫細胞DNA酶切重組DNA篩選獲目的基因轉化細菌，培養存在于轉化細菌內，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary)。制備探針時，增殖細菌，擴增、提取質粒，用限制酶切，回收特定基因片段，經標記則成為基因組DNA探針。當前第80頁\共有167頁\編于星期五\10點81ConstructionofaHumanGenomicLibrary當前第81頁\共有167頁\編于星期五\10點82RestrictionEnzyme-ActionofEcoRI

當前第82頁\共有167頁\編于星期五\10點83DNArecombination當前第83頁\共有167頁\編于星期五\10點84cDNA探針制備逆轉錄合成cDNA分離純化mRNAPCR擴增當前第84頁\共有167頁\編于星期五\10點85

根據已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段或根據蛋白質氨基酸序列推導出核酸順序加以人工合成。化學合成（寡核苷酸探針制備）Geneticcode當前第85頁\共有167頁\編于星期五\10點86合成寡核苷酸探針注意原則：1）長度（18-50bp);2）G:C對含量40%-60%；3）探針內避免互補；4）避免同一堿基連續出現；5）與非靶序列有70%以上同源性或連續8個以上堿基序列相同，最好不用。Home當前第86頁\共有167頁\編于星期五\10點87三、核酸探針的標記

為確定探針是否與相應基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號。當前第87頁\共有167頁\編于星期五\10點88（一）標記物

1、理想標記物應具備的特性：1）標記前后探針的基本結構、化學性質相同;2）特異性強、本底低、重復性好；3）操作簡單、節時；4）安全、無環境污染。當前第88頁\共有167頁\編于星期五\10點89放射性核素非放射性標記主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。優點：靈敏度和特異性極高，可檢出樣品中少于1000個分子的核酸量。缺點：半衰期短，穩定性差，污染環境、檢測需時較長。主要有：生物素、地高辛、辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶及FITC等。優點：具有穩定、安全、經濟及實驗周期短等特點，近年來應用越來越廣泛。缺點：靈敏度低于放射性核素標記的探針2、標記的種類當前第89頁\共有167頁\編于星期五\10點90（二）探針的標記方法放射性同位素標記法缺口平移法(Nicktranslation)隨機引物延伸法(Randomprimerlabelling)末端標記法(Endlabelling)非放射性同位素標記法酶促標記法、化學標記法當前第90頁\共有167頁\編于星期五\10點91缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`聚合酶活性和5`→3`外切酶活性相結合。DNAaseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。

這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。當前第91頁\共有167頁\編于星期五\10點92切口移位（平移）法當前第92頁\共有167頁\編于星期五\10點93當前第93頁\共有167頁\編于星期五\10點94當前第94頁\共有167頁\編于星期五\10點95隨機引物標記法原理

用一些六核苷酸作為隨機引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補結合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補配對原則不斷在其3`-OH端添加標記的單核苷酸修補缺口，合成新的標記的探針片段。當前第95頁\共有167頁\編于星期五\10點96當前第96頁\共有167頁\編于星期五\10點97當前第97頁\共有167頁\編于星期五\10點98末端標記法原理（1）一種是在5`末端加成標記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的ATP轉移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉移酶摻入一個單標記的ddUTP。當前第98頁\共有167頁\編于星期五\10點99末端標記法當前第99頁\共有167頁\編于星期五\10點100當前第100頁\共有167頁\編于星期五\10點101非放射性同位素標記法光敏生物素標記核酸

由一個光敏基團、一個連接臂和一個生物素基團組成。光生物素的光敏基團是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結合。酶促標記法將標記物預先標記在核苷酸分子上，利用酶促聚合反應將其摻入到待標記的探針分子中去，或將核苷酸分子上的標記基團交換到核酸分子上。當前第101頁\共有167頁\編于星期五\10點102探針的純化1、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質分離，常用凝膠基質是SephadexG-503、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針當前第102頁\共有167頁\編于星期五\10點103當前第103頁\共有167頁\編于星期五\10點104核酸分子雜交信號的檢測放射性同位素標記探針：

放射自顯影。

非放射性同位素標記探針：

偶聯反應+顯色反應。當前第104頁\共有167頁\編于星期五\10點105放射自顯影

通過X光片檢測放射性核素標記物。其基本原理為：同位素在不斷衰變過程中釋放出β-粒子，粒子撞擊X光片感光層，形成潛在影象，經過顯影即可見到成像。當前第105頁\共有167頁\編于星期五\10點1061．偶聯反應可以通過抗原-抗體免疫反應系統與顯色體系偶聯。地高辛系類固醇半抗原化合物，地高辛標記探針雜交信號可通過酶聯免疫法與抗地高辛抗體和堿性磷酸酶的復合物結合，再進行酶促顯色反應。2．顯色反應（1）酶促顯色法：最常用的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶（2）熒光法：熒光素探針主要用于原位雜交，最常用的為FITC。（3）化學發光法：化學發光指在化學反應過程中伴隨的發光反應。化學法檢測當前第106頁\共有167頁\編于星期五\10點107當前第107頁\共有167頁\編于星期五\10點108地高辛標記探針雜交信號檢測Home當前第108頁\共有167頁\編于星期五\10點109四、核酸分子雜交技術

核酸分子雜交

固相雜交液相雜交印跡雜交原位雜交固相雜交：結合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進行雜交反應。當前第109頁\共有167頁\編于星期五\10點110菌落雜交(Colonyinsituhybridization)常用的固相雜交類型Southern印跡雜交(Southernblotting)

原位雜交(insituhybridization)其他類型雜交（Otherhybridization)斑點雜交(Dotblotting)Northern印跡雜交(Northernblotting)當前第110頁\共有167頁\編于星期五\10點111核酸分子雜交的基本程序當前第111頁\共有167頁\編于星期五\10點112

此技術由Southern1975年首先設計。被檢測對象為DNA。

（一）Southern印跡雜交當前第112頁\共有167頁\編于星期五\10點113PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無水乙醇離心當前第113頁\共有167頁\編于星期五\10點114帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術流程當前第114頁\共有167頁\編于星期五\10點1151、待測核酸樣品的制備

⑴、裂解或破碎細胞⑵、抽取純化基因組DNA

⑶、限制酶消化DNA為大小不同的

DNA片段當前第115頁\共有167頁\編于星期五\10點1162、待測DNA樣品的電泳分離

⑴、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠

⑵、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應，大分子

DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶

⑶、分子量標準：經HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標準可用核素標記當前第116頁\共有167頁\編于星期五\10點1173、凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。4、Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉移到一定的固相支持物上的過程。當前第117頁\共有167頁\編于星期五\10點118固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應具備的特性①具有較強結合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應③與核酸分子結合穩定牢固④具有良好的機械性能非特異吸附少當前第118頁\共有167頁\編于星期五\10點119（2）常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優點是吸附能力強，雜交信號本底低。缺點是DNA分子依靠疏水作用而吸附在膜上，結合不牢固

②尼龍膜：優點是結合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高

③化學活化膜：優點：DNA與膜共價結合；對不同大小的DNA片段有同等結合能力；缺點：結合能力較低當前第119頁\共有167頁\編于星期五\10點120當前第120頁\共有167頁\編于星期五\10點121當前第121頁\共有167頁\編于星期五\10點122當前第122頁\共有167頁\編于星期五\10點123當前第123頁\共有167頁\編于星期五\10點124Southern印跡的常用方法

利用濃鹽轉移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。（1）毛細管虹吸印跡法當前第124頁\共有167頁\編于星期五\10點125白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉膜當前第125頁\共有167頁\編于星期五\10點126當前第126頁\共有167頁\編于星期五\10點127（2）真空轉移法

此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。當前第127頁\共有167頁\編于星期五\10點128真空轉膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉膜當前第128頁\共有167頁\編于星期五\10點129當前第129頁\共有167頁\編于星期五\10點130（3）電轉法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。當前第130頁\共有167頁\編于星期五\10點131當前第131頁\共有167頁\編于星期五\10點132

5、Southern雜交

⑴、預雜交：封閉膜上能與DNA結合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液。

⑵、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA

雜交，雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

⑶、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結合的DNA。當前第132頁\共有167頁\編于星期五\10點1336、雜交結果檢測

1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針

2、比色或化學發光檢測：適于非核素標記的探針當前第133頁\共有167頁\編于星期五\10點1347、Southern雜交在醫學中的應用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長度多態性的分析當前第134頁\共有167頁\編于星期五\10點135（二）Northern印跡雜交

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、檢測目的RNA的存在與否及含量

3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測樣品為總RNA或mRNA

這是經典的RNA分析法，目前主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平以及比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。當前第135頁\共有167頁\編于星期五\10點136Northern印跡與Southern印跡的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA當前第136頁\共有167頁\編于星期五\10點137

←28S←18S

RNA電泳當前第137頁\共有167頁\編于星期五\10點138當前第138頁\共有167頁\編于星期五\10點139β-1，4糖基轉移酶在損傷坐骨神經中的表達當前第139頁\共有167頁\編于星期五\10點140Northern雜交的主要用途

主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平以及比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。當前第140頁\共有167頁\編于星期五\10點141（三）Western印跡雜交

檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗血清對蛋白質進行鑒定及定量的方法。當前第141頁\共有167頁\編于星期五\10點142主要步驟：蛋白質樣品的制備PAGE電泳蛋白質的電轉移：PVDF膜靶蛋白的免疫學檢測靶蛋白于第一抗體（一抗）反應與標記的第二抗體（酶標二抗）反應顯色反應：酶促反應當前第142頁\共有167頁\編于星期五\10點143當前第143頁\共有167頁\編于星期五\10點144當前第144頁\共有167頁\編于星期五\10點145（四）斑點印跡雜交和狹線印跡雜交Dotblottingandslotblotting原理：是將被檢標本的RNA或DNA變性后直接點樣吸附于硝酸纖維膜上，然后用標記探針與之雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。

優點：用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡便、快速、靈敏、樣品用量少。缺點：不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。當前第145頁\共有167頁\編于星期五\10點146當前第146頁\共有167頁\編于星期五\10點147當前第147頁\共有167頁\編于星期五\10點148(五）原位雜交insituhybridization

又分為菌落雜交或噬菌斑、以及真核細胞原位雜交。

它是利用標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術。組織細胞原位雜交是檢測細胞內的核酸片段，它保持了細胞的形態結構和組織的立體構型，適合于核酸定位和分布研究。當前第148頁\共有167頁\編于星期五\10點149核酸原位雜交的基本步驟當前第149頁\共有167頁\編于星期五\10點150HPVFISH當前第150頁\共有167頁\編于星期五\10點151菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。當前第151頁\共有167頁\編于星期五\10點152當前第152頁\共有167頁\編于星期五\10點153當前第153頁\共有167頁\編于星期五\10點154液相雜交

指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。RNA酶保護分析法核酸酶S1保護分析法當前第154頁\共有167頁\編于星期五\10點155（六）RNA酶保護分析法1、RNA酶保護分析法原理

RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護，稱RNA酶保護分析法。當前第155頁\共有167頁\編于星期五\10點156

待測RNA樣品↓←單鏈RNA探針液相雜交↓