NIPT-假陽性、假陰性問題分析東

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司陳樣宜出生缺陷技術總監2

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日人類染色體CABDEFG2染色體結構NGS，芯片，PCR等分子手段的主要檢測目標為常染色質區，而隨體，主縊痕，次縊痕，異染色質區域多是高度重復區域，一般不能通過NGS等分子方法檢測這些區域的結構和數目異常3染色體異常起源：減數分裂1.卵子成熟4染色體異常起源：減數分裂精子成熟5染色體異常起源：早期有絲分裂6染色體異常起源：嵌合體分化7染色體異常信號Z值的計算假設21染色體出現三體異常，胎兒DNA濃度為Fc，則母體濃度為(1-Fc)；N為某次實驗有效測序reads數目，r為參考人群21號染色體占常染色體基因組的比例，Sd為標準差，那么理論可獲得該染色體的reads數目X為：X=N*r*

(1-Fc)+N*r*3/2*Fc=N*r*(1+1/2*Fc)-----（1）由Z=(X/N-r)/Sd

，聯合（1）可知：Z=[r*(1+1/2*Fc)-r]/Sd=1/2*r*Fc/Sd-----（2）-----（3）由CV=Sd/r可得Z=1/2*Fc/CV8濃度越高，檢測值越高，容易檢出9染色體異常信號Z值的計算一般的情況下，假設胎兒DNA濃度為Fc，測序量為M，則對于任意一段N兆大小的缺失或重復區域，其標準分數的期望值的絕對值為：|Z|=C*Fc*sqrt(N)*sqrt(M)

-----（4）Z值期望與四個因素相關：1.胎兒比例成正比。2.檢測區域大小開平方成正比。3.數據量開平方成正比。4.發生缺失重復區域的特征值。10外周血游離DNA純化：片段篩選?

DNA片段篩選---

排除母體基因組干擾---

確保檢測的對象為血漿游離DNA11外周血游離DNA純化：片段篩選精準的片段篩選，可以大幅度提高胎兒游離DNA比例12胎兒比例預測：片段統計片段分布的統計---質控女胎的胎兒比例---質控檢測對象為孕婦13胎兒比例預測效果14NIPT數據分析管理軟件質控指標15病例解讀：11.早孕唐篩結果21-三體高風險2.無創基因檢測21-三體高風險（Z=7.395）3.QF-PCR21-三體4.染色體核型結果47,XY,+2116病例解讀：21.早孕唐篩結果21-三體高風險18-三體高風險2.無創基因檢測18-三體高風險（Z=8.531）3.QF-PCR18-三體4.

染色體核型結果47,XX,+1817病例解讀:31.

中孕超聲結構篩查（1）心臟發育異常（2）顱內結構發育異常（3）雙腎實質回聲增強2.無創基因檢測13-三體高風險（Z=9.251）3.

染色體核型結果47,XY,+1318病例解讀:41.

中孕超聲結構篩查（1）心臟發育異常（2）顱內結構發育異常（3）雙腎實質回聲增強2.

無創基因檢測13-三體（7.269）18-三體（10.712）19病例解讀:43.QF-PCR結果：胎兒A:

47,XY,+18胎兒B:

47,XX,+1320NIPT的假陽性?

NIPT的敏感性和特異性盡管很高，但只能用于篩查，而不能替代確認性的染色體核型分析。?

胎兒游離DNA來自胎盤，而胎盤的核型存在與胎兒不一致的情況。?

游離DNA大部分來自母體，母體的缺失重復與其他生理因素均可干擾無創的結果。21病例解讀:51.

中孕期唐篩2.

無創基因檢測13-三體高風險（Z=7.395）3.QF-PCR未見21-三體未見18-三體未見13-三體4.

染色體核型結果46，XY22病例解讀:5分娩后取胎盤組織QF-PCR結果：限制性胎盤嵌合體

46,XY/47,XY,+1347,XY,+13限制性胎盤嵌合體：是指胎盤出現正常與異常的染色體嵌合體,而胎兒核型正常[Dagmar

K,JMedGenet,1996]46,XY23病例解讀:61.早孕唐篩結果21-三體高風險2.無創基因檢測21-三體高風險（Z=11.529）3.QF-PCR:21-UPDA為拷貝數探針檢測出整條21號染色體Log2

Ratio都為0，因此推測21號染色體拷貝數為正常2，不存在任何缺失和重復。4.染色體核型結果46,XX5.CMA結果B為SNP探針檢測到表示雜合子的中間“0”基線消失，因此推測該病例21號染色體為純合子，即兩條都來自同一個親代24病例解讀:6父親母親21號：STR均為單峰結合胎兒與夫妻雙方的峰型比較提示胎兒21號染色體的STR峰均來自母親胎兒UPD-21胎盤嵌合體胎盤47,+21胎盤UPD-2125假陽性的產生：減I不分離1

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5聯會減I不分離減II6

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7次級卵母細胞6

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512345胎兒三體自救受精精子胎盤部分三體自救6

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7受精卵6

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7胎兒67胎盤（嵌合體）26假陽性的產生：減II不分離1

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5聯會減I6

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7卵子減II不分離初級卵母細胞次級卵母細胞1

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2123451234512345胎兒三體自救3

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3受精4

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5精子胎盤部分三體自救6

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7胎兒676767受精卵胎盤（嵌合體）27假陽性的產生：母體CNV28假陽性的臨床意義1.減I不分離或減II不分離產生的假陽性有一定的機會形成單親二倍體。2.單親二倍體的LOH增加了單基因病風險。3.印記區的iUPD、hUPD需要STR、基因芯片才能發現，核型分析不能識別。4.15號染色體會引起PWS或Angeleman綜合征。其他染色體致病性不明。5.母體來源的CNV存在一定的致病性可能。6.胎兒比例高的4拷貝重復可能被誤認為母體重復。29病例解讀:71.NIPT：T15

Z=14.736（短片段

cffDNA

陽性檢測值Z=17.383）2.染色體核型結果：46,XY3.芯片結果

：15q24.1q26.3x2

hmz

15q11.2-q13.1無異常？30病例解讀:74.父母芯片驗證：15q24.1q26.3x2

hmz

為母源iso-UPD，15號染色體其他位置為母源het-UPD，可能存在致病性。31病例解讀:81.基本信息：年齡：33；孕周：23w+5；錯過血清學篩查2.NIPT：T22

Z=5.474（短片段

cffDNA

陽性檢測值Z=6.441）32病例解讀:83.羊水核型分析：22號染色體部分三體33病例解讀:84.羊水高通量測序：mar染色體為22號染色體部分四體34NIPT的假陰性?

NIPT的假陰性率約為1/300-1/50，所檢測樣本中發生概率約為1/40000-1/10000。?

胎兒游離DNA來自胎盤，而胎盤的核型存在與胎兒不一致的情況。?

游離DNA大部分來自母體，母體的缺失重復與其他生理因素均可干擾無創的結果。檢測判斷陽性陰性NIPT陽性陰性陽性T21996254189,22560T21T18256陰性T183189,958T13陽性陰性T1334072190,17135病例解讀:91.基本信息：年齡：25；孕周：23w；血清學低風險；胎兒偏小2.NIPT結果：陰性3.28周超聲仍提示胎兒偏小，以無創結果陰性為由未作進一步診斷36病例解讀:94.出生后特殊面容，核型分析發現易位型21三體37病例解讀:95.無創樣本出錯了？備份血漿重測序，仍為陰性；血漿SNP捕獲測序證實未做錯，評估出該女胎胎兒比例為12%，與無創預測13.9無明顯差異。染色體孕婦白細胞孕婦外周血游離DNAAAaa/AAab

BBbb/BBabAA76BB3chr1chr276344chr37575chr48181chr57575chr67878chr73333chr85353chr94646chr10chr11chr12chr13chr14chr16chr17chr18chr20chr21chr22合計5564771433921160144659315268611051556477143392116014465931526861105155250455250438病例解讀:95.胎盤嵌合體？六個位置的胎盤組織及其父母的染色體高通量檢測結果：來源UniqueReads6,695,6627,248,2643,941,6553,755,212430368935606064,237,0193,735,933T21T18T13胎兒面胎兒面30.25723.473-0.7192.303-0.695-0.621-0.1130.077-2.856-3.595-1.8461.62-0.761-0.4242.0271.115-2.0781.184-2.521-1.748母體面母體面胎兒面30.70522.491-0.4081.843胎兒面父親外周血母親外周血39假陰性的原因（1）1

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512345胎兒未三體自救受精精子胎盤大部分三體自救6

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7胎兒67胎盤（嵌合體）40假陰性的原因（2）1

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5聯會減I6

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5精子胎盤大部分三體自救6

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767676767受精卵胎盤（嵌合體）胎兒41假陰性的原因（3）有絲分裂錯誤的三體細胞恰好發育成胎兒而胎盤細胞由多種核型細胞組成，此時由于單體細胞比三體細胞多，血漿游離DNA可能檢測到小于-3的信號。三體細胞發育成胎兒部分有絲分裂錯誤卵裂內細胞團（胎兒）受精卵多種核型細胞發育成胎盤滋養層細胞（胎盤）42病例解讀:101.基本信息：年齡：36；孕周：21w+4；2.NIPT結果：21號

Z=-4.558（短片段

cffDNA

21號

Z=-6.855）43病例解讀:103.臨床：21單體，孕中期存活極低；大排畸未見明顯異常；未做穿刺診斷；出生后特殊面容。4.核型結果：47，XX，+2144假陰性的原因（4）卵裂受精卵內細胞團（胎兒）三體細胞發育成胎兒多種核型細胞發育成胎盤滋養層細胞（胎盤）5病例解讀:111.基本信息：年齡：26；孕周：18w+4；2.NIPT結果1：21號

Z=0.776（短片段

cffDNA

21號Z=-0.168）46病例解讀:113.臨床：大排畸未見明顯異常，出生42天死亡。4.核型結果：46，XY，+21，der(21:21)(q10:q10)47病例解讀:115.重復NIPT結果：序號UniqueReads5,036,279T21T18T130.62XY第一次上機結果（第二管血漿）第二次上機結果（第二管血漿）-0.796-0.168-1.0260.684-4.862-5.46917.98118.5446,755,5720.211第四次上機結果（第一管血漿）4,831,0630.163-1.37-0.404-5.95218.69序號UniqueReadsT21T18T13XY第一次上機結果（第二管血漿）45,442,045-0.354-0.212-2.049-8.08826.405第二次上機結果（第二管血漿）第三次上機結果（第三管血漿）第四次上機結果（第一管血漿）45,442,04543,041,48640,970,148-0.017-0.301-0.7000.0150.0600.126-1.020-1.563-1.691-8.197-8.005-8.07526.74427.45128.99148假陰性的原因（5）胎兒比例低于6%時，即使以2為臨界切割值仍存在一定的風險胎兒DNA濃度f%=1%Z-score>3（FN）98.63%90.98%70.92%38.91%13.77%2.61%Z-score>2（FN）86.81%58.67%24.93%6.09%f%=2%f%=3%f%=4%f%=5%0.64%f%=6%0.03%f%=7%0.25%0.00%f%=8%0.03%0.00%f%=9%0.00%0%f%=10%0%0%49假陰性的原因（4）序號診斷核型胎兒比例1

檢測值1

胎兒比例2

檢測值21247,XX,+2147,XY,+1847,XX,+2147,XY,+2147,XY,+1847,XY,+1847,XY