蛋白質(zhì)提取與粗分級張明生物技術(shù)31002班2013年11月18日第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化概述蛋白質(zhì)主要有20種氨基酸以肽鍵項(xiàng)鏈，由于氨基酸的種類含量幾排列順序不同形成了百億種以上的蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的目的是提高蛋白質(zhì)的純度蛋白質(zhì)分離純化與鑒定一般包含六個(gè)步驟蛋白質(zhì)分離主要步驟選擇實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級蛋白質(zhì)的細(xì)分級蛋白質(zhì)的鑒定選擇易獲取、含量高、成本低的材料根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的特點(diǎn)選取合適的方法采用特定的緩沖液溶解材料，提取采用簡單的技術(shù)手段初步分離蛋白質(zhì)采用多種技術(shù)手段獲得高純度的蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等進(jìn)行測定實(shí)驗(yàn)材料的選擇要求：目標(biāo)材料含蛋白質(zhì)含量高雜質(zhì)少容易獲得成本低舉例：植物的不同器官（根、莖、葉）、不同組織等預(yù)處理液體材料：過濾、離心等固體材料：洗滌、材料破碎等除雜第二節(jié)蛋白質(zhì)的提取除少數(shù)蛋白質(zhì)難溶解在普通溶液外，大多數(shù)蛋白質(zhì)都能能溶解于水、稀鹽溶液、稀酸溶液或有機(jī)溶劑中，因此采用相應(yīng)的溶液即可把目標(biāo)蛋白質(zhì)提取出來提取蛋白質(zhì)需要選擇不同的緩沖液，這些緩沖液通常都含有九種成分蛋白質(zhì)提取緩沖液的成分成分常用作用控制溶液PH的緩沖對Na2HPO3/NaH2PO3等維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，提高溶解度控制離子強(qiáng)度的無機(jī)鹽一定濃度的NaCl/KCl維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能控制氧化還原狀態(tài)的還原劑?-硫基乙醇、DDT還原作用蛋白酶抑制劑絲氨酸蛋白酶等，如表7-2抑制目標(biāo)蛋白的降解蛋白質(zhì)提取緩沖液的成分成分常用作用金屬離子螯合劑EDTA、EGTA等消除某些金屬離子對目標(biāo)蛋白的影響標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白提高蛋白質(zhì)濃度，利于其穩(wěn)定去污劑曲拉通X-100，Tween-20，SDS等提取膜蛋白水和防腐劑避免雜菌污染甘油利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的保持第三節(jié)蛋白質(zhì)粗分級使用蛋白質(zhì)提取液提取實(shí)驗(yàn)材料后，獲得的蛋白質(zhì)粗提液中，目標(biāo)蛋白的濃度很低，這使得我們可以采用簡單的方法濃縮目標(biāo)蛋白，并可將粗提液初步分為幾份，這些純化方法就是蛋白質(zhì)的初分級蛋白質(zhì)的粗分級主要有以下七種:1.硫酸銨分級沉淀2.有機(jī)溶劑分級沉淀3.超速離心法4.等電點(diǎn)沉淀5.透析法6.超濾法7.結(jié)晶法1.硫酸銨分級沉淀蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析.在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來，常用的中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等。中性鹽對球狀蛋白的溶解度有顯著的影響：鹽溶：低濃度的中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析：高濃度的中性鹽，如飽和(NH4)2SO4使蛋白質(zhì)溶解度下降，從溶液中沉淀析出。鹽析法在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等，其中以硫酸銨最為常用。因?yàn)榱蛩徜@在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小(在25℃時(shí)，溶解度為767g／L；0℃時(shí)，溶解度為697g／L)、不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其他中性鹽進(jìn)行鹽析。

硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)主要與鹽濃度有關(guān)，硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實(shí)際的克數(shù)或克分子數(shù)，這是由于當(dāng)固體硫酸銨加到水溶液中去時(shí)，會出現(xiàn)相當(dāng)大的非線性體積變化。

蛋白質(zhì)溶液加入硫酸銨靜止沉淀離心或過濾收集沉淀操作流程：蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度鹽析鹽溶影響鹽析的因素溫度pH值蛋白質(zhì)濃度2.有機(jī)溶劑分級沉淀與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度也隨溫度、pH和離子強(qiáng)度而變化。在一定溫度、pH和離子強(qiáng)度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此控制有機(jī)溶劑濃度也可以分離蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑冷卻到-40℃至-60℃在不斷地?cái)嚢柘轮鸬渭尤胗袡C(jī)溶劑以防局部濃度過高有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一使水溶液的介電常數(shù)降低。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。3.超速離心法蛋白質(zhì)在離心場中沉降時(shí):Fc(離心力)=

mpω2x（離心加速度）Fb(浮力)=Vpρω2χ=mpυρω2xFf(摩擦力)=fν=

f(dx/dt)通過測定沉降界面的移動速度測定Mr.dx/dt為常數(shù)

Fc-Fb=Ff(dχ/dt)mp（1-υρ）