內容：第一節轉基因動物的制備第二節轉基因動物應用前景第三節轉基因動物研究存在的問題第一頁，共131頁。一基因工程基因工程技術的特點是基因體外重組，即在離體條件下對DNA分子切割并將其與載體DNA分子連接，得到重組DNA。世界上第一批重組DNA分子誕生于1972年，次年幾種不同來源的DNA分子裝入載體后被轉入到大腸桿菌中表達，標志著基因工程正式登上歷史舞臺。第二頁，共131頁。二轉基因動物所謂轉基因動物（Transgenicanimal）是指在基因組內穩定地整合以實驗方法導入的外源基因，并且外源基因可以穩定地遺傳給后代的遺傳工程動物。第三頁，共131頁。轉基因動物技術基礎重組DNA技術胚胎移植技術體細胞克隆技術基因定向整合技術第四頁，共131頁。1980年，Gordon等人首先育成轉生長素基因小鼠顯微注射純化的DNA的方法。生長速度快2－4倍、體形大一倍的轉基因“碩鼠”。從此轉基因動物技術轟動了整個生命科學界。發表在1982年的nature雜志上。第五頁，共131頁。三轉基因動物的關鍵步驟

外源目的基因的制備外源目的基因有效的導入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的以上細胞，選擇合適的體外培養系統和宿主動物轉基因細胞胚胎發育及鑒定篩選所得的轉基因動物品系第六頁，共131頁。核心技術

目前，制備轉基因動物的主要方法有：

基因顯微注射法

胚胎干細胞移植法反轉錄病毒感染法

精子載體導入法等。第七頁，共131頁。1、原核期胚胎顯微注射法

基本原理是：通過顯微操作儀將外源基因直接用注射器注入受精卵（原核胚胎的原核內），利用受精卵繁殖中DNA的復制過程，將外源基因整合到DNA中，再發育成轉基因動物。第八頁，共131頁。主要步驟目的DNA制備與純化；動物的挑選、超排卵與取卵；DNA的注入；卵的轉移；轉基因動物的獲得第九頁，共131頁。詳解約400倍的顯微鏡下，用一根直徑80-100微米的玻璃棒將胚胎固定，再用另一根直徑1-5微米的玻璃管刺入細胞原核，把DNA溶液直接注射到原核期胚胎的一個或兩個原核中。胚胎再經過1-3小時培養，證明沒有裂解后，移植到受體母畜的輸卵管內；也可體外培養發育到桑椹胚再進行胚胎移植。第十頁，共131頁。轉基因胚胎的鑒定標記基因篩選綠色熒光蛋白基因、熒光素酶基因在熒光顯微鏡下觀察，陽性胚胎中全部細胞發出熒光。第十一頁，共131頁。分子技術篩選采用胚胎切割的方法獲得細胞，進行DNA提取后，采用PCR擴增、southern雜交等手段檢測。第十二頁，共131頁。舉例——顯微注射生產轉基因羊羊的超數排卵受精卵采集顯微注射胚胎移植體內發育出身、鑒定第十三頁，共131頁。優點是目前最成熟的轉基因動物制備方法第十四頁，共131頁。不足——1.成功率較低最多1%。至今未取得改進。每生產一頭轉基因羊或豬，大體需要注射100個單細胞胚。每生產一頭轉基因牛，需要注射500-1000個單細胞胚胎。第十五頁，共131頁。不足——2.需要大量的受體動物每生產一頭轉基因牛需要使用幾百頭牛做受體。第十六頁，共131頁。不足——3.基因非定向整和基因隨機整和。大多數轉基因動物都表現出一定生理異常。基因產品的生理功能會改變。如：生長激素受下丘腦控制，而轉基因動物的生長激素卻在肝臟等中表達，不受生理調節。第十七頁，共131頁。2、反轉錄病毒感染法

將目的基因重組到反轉錄病毒載體上：（1）人為感染著床前或著床后的胚胎。（2）直接將胚胎與能釋放反轉錄病毒的單層培養細胞共孵育以達到感染目的。可通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中。第十八頁，共131頁。不足載體容量太小，可插入的目標基因最大允許長度是8KB。不能控制轉染時間。至今沒有一頭成功，幾乎都是嵌合體。第十九頁，共131頁。3、胚胎干細胞方法胚胎干細胞（ES）當被注入囊胚腔后可以參與包括生殖腺在內的各種組織嵌合體的形成。將外源DNA導入胚胎干細胞就可以實現基因的轉移。第二十頁，共131頁。4、利用胚胎干細胞和胚胎移植技術實現轉基因動物制備

從胚胎分離出胚胎干細胞，通過轉錄將外源基因導入細胞內，再將其轉入到植入前胚胎的胚泡腔。這些帶有外源基因的胚胎干細胞可嵌入宿主囊胚的內細胞團中參與胚胎發育。出生的動物其生殖系統就有可能整合上外源基因。再通過雜交繁育就可得到具有純合目的基因的個體，即轉基因動物。

第二十一頁，共131頁。5、精子載體法顯微注射技術的效率很低，設備昂貴。直接用精子作為外源DNA載體的轉移方法。第二十二頁，共131頁。基本原理和方法精子直接與外源DNA混合培養，外源基因可以直接進入精子頭部，受精后就可發育成轉基因動物。后來Rottman對此方法進行了改進，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質體包埋，使脂質體與DNA相互作用形成脂質體——DNA復合物。這種復合體比較容易和精子細胞融合，從而進入細胞內。第二十三頁，共131頁。主要問題重復性不好第二十四頁，共131頁。四、轉基因動物鑒定技術

1、聚合酶鏈式反應（PCR）技術設計一對特異性引物，以組織提取的DNA為模板進行PCR擴增，通過對擴增產物進行序列分析就可以實現轉基因動物的鑒定。第二十五頁，共131頁。2、斑點雜交動物DNA的提取點于硝酸纖維素膜探針雜交放射自顯影第二十六頁，共131頁。五、轉基因動物技術的

意義與最新進展

第二十七頁，共131頁。1、優良動物育種通過外源基因的導入達到使畜禽生長速度加快、產量（肉、蛋、奶）提高、耗料減少和品質改進的目的。第二十八頁，共131頁。2、動物模型與基因治療可以通過精確地失活某些基因或增強某些基因的表達來制作各種研究人類疾病的動物模型。已建立的遺傳疾病轉基因小鼠模型有：動脈粥狀硬化、鐮刀形細胞貧血癥、老年癡呆癥、自身免役病、淋巴系統病、皮炎和前列腺癌等。第二十九頁，共131頁。3、醫藥領域的應用利用轉基因動物生產人類藥用蛋白等非常規畜牧產品，是目前世界上轉基因動物研究的熱點之一。第三十頁，共131頁。4、異種器官移植中的應用異種器官移植首先要克服的障礙是移植后發生的免役排斥反應。第三十一頁，共131頁。例1：建立免役排斥相關基因轉基因豬可先將少量的人類基因注入到一至兩個細胞階段的豬胚胎中去，得到一兩只會天然產生這些保護性蛋白的轉基因小豬。這些特別培育的家豬的器官組織也就可以存活在人類的血液中間了。第三十二頁，共131頁。例2：不含“排斥基因”的克隆豬

這種“基因敲除”基因克隆豬敲除了引起移植排斥反應的“禍首”——一種特定基因（半乳糖苷轉移酶基因），從“源頭”上減少甚至消除了引起排斥反應的可能性。第三十三頁，共131頁。美國馬薩諸塞洲的Immerge生化治療公司第三十四頁，共131頁。特點關閉一個受人體排斥的基因——3-半乳糖轉移酶（GT）基因。GT基因控制一種酶，這種酶使豬細胞表面產生一種糖類物質。當豬器官或細胞被移植給人體時，人類免役系統能識別這種酶，從而產生強烈的排斥反應，把移植來的器官或細胞視為外來異物進行攻擊。第三十五頁，共131頁。六、轉基因動物生物反應器第三十六頁，共131頁。1、基因工程藥物回顧1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場，標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。第三十七頁，共131頁。2、轉基因生物反應器發展歷程細菌基因工程細胞基因工程轉基因動物反應器第三十八頁，共131頁。3、分類與比較轉基因微生物（主要是細菌）生物反應器轉基因植物生物反應器轉基因動物生物反應器第三十九頁，共131頁。轉基因微生物最早的轉基因生物反應器是通過原核生物來表達目的基因蛋白。目前市場上的基因工程藥物絕大多數是采用這一方法。微生物具有結構簡單、繁殖迅速、容易培養等特點，而成為良好的轉基因對象。第四十頁，共131頁。第四十一頁，共131頁。兩大缺陷：一是細菌等微生物本身是低等生物，構建好的哺乳動物或人類的基因導入后不能很好表達。二是即使表達了，產物往往沒有活性，必須經過糖基化、羧基化等一系列修飾加工才能成為有效的藥物。第四十二頁，共131頁。轉基因動物的產生微生物基因工程菌的不足使人們打算用動植物細胞株代替工程細菌等轉基因微生物。于是出現了細胞基因工程。但是該方法也存在不足之處。如：培養條件苛刻、成本高等。由此人們又想到，是否能將人類所需要的目的基因直接導入哺乳動物如鼠、兔、羊、豬等體內，使這種目的基因在哺乳動物體內表達，從而獲得目的基因的產品。于是開始了轉基因動物的研究。第四十三頁，共131頁。微生物反應器植物反應器動物反應器

(一)優點1可以利用發酵工程技術大規模生產。2胞外活性物質制備容易。

（二）不足1哺乳動物或人類的基因往往不能表達。有些表達了，卻沒有活性，需要進一步修飾。2真核生物蛋白質翻譯后加工的精確性有限。3需要大型發酵設備和車間。4細菌發酵常形成不溶聚合物，使下游加工成本增加。

（一）優點1可大規模種植，上游生產成本較低。作為食物可省去下游加工步驟。2轉基因植物自交后可得到穩定遺傳的遺傳性狀。3可利用植物組織和細胞培養技術實現大量制備。

（二）不足1植物種植受季節、環境影響。2需專門的活性物質分離設備與技術。3植物細胞培養需要發酵罐等設備和技術支持，成本較高。

（一）優點1易養殖，實現大規模制備。2通過乳腺和血液制備活性物質簡單易行。3可以通過動物細胞培養實現大量制備。

（二）不足1細胞培養需要昂貴的培養基和設備。2轉基因動物制備成本昂貴。3轉基因動物易產生一些倫理問題。第四十四頁，共131頁。4、動物乳腺生物反應器乳腺是一個外分泌器官，乳汁不進入體內循環，因此不會影響到轉基因動物本身的生理代謝反應。從轉基因乳汁中獲取目的基因產物，不但產量高、易提純，而且表達的蛋白經過充分的修飾加工，具有穩定的生物活性。第四十五頁，共131頁。原理是將外源基因置于乳腺特異性調節序列（乳蛋白基因的啟動子）之下，使之在乳腺中表達，然后通過回收乳汁獲得重要價值的生物活性蛋白。第四十六頁，共131頁。應用：轉基因兔奶可治療嬰兒先天性疾病

患有龐普病的嬰兒體內一種可促進糖原質代謝的酶有缺陷。荷蘭研究人員培育出一種轉基因兔，兔奶中表達這種酶，因此飲用這種奶可以治療這種疾病。第四十七頁，共131頁。經濟效益英國羅斯林研究所研制成功的轉基因羊乳汁中含有α1-抗胰蛋白酶，它可以治療肺氣腫。每升這樣的羊奶可售6000美元。第四十八頁，共131頁。5、動物血液生物反應器

目前，醫用血清蛋白主要由人血提取，而有限的血液資源極大地限制了血清蛋白的生產和使用。如果利用轉基因動物就可以在血液中表達人類目的基因，用于血清蛋白制備的原料。第四十九頁，共131頁。適合：比較適合生產人血紅蛋白、抗體和生產非生物學活性的融合蛋白。這是由于有活性的蛋白或多肽（如激素、細胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等）會進入動物血液循環系統而影響動物的健康。

第五十頁，共131頁。七、存在的問題外源基因表達效率低和遺傳丟失轉基因技術有待改善成活率低以及有不良表現存在安全性問題其它問題第五十一頁，共131頁。專題：多利羊帶來的挑戰與困惑

一、多利羊風暴二、從一個細胞到一只羊

三、多利羊實驗的設計與實施

四、多利羊實驗的理論意義和實踐意義

五、多利羊實驗帶來的困惑

第五十二頁，共131頁。一、多利羊風暴

1997．2．27

Nature（385：810－813）

英國愛丁堡羅斯林研究所

伊恩威爾穆特小組：

多利羊

1996.7出生

1996.11收到文章

1997.2文章發表第五十三頁，共131頁。多利羊之父威爾穆特第五十四頁，共131頁。多利羊成為明星第五十五頁，共131頁。多利和它的孩子返回第五十六頁，共131頁。

文章發表，在全世界引起巨大反響。

一方面學術界高度評價

1997.3.2美國華盛頓郵報

奧勒岡州沃爾小組：成功克隆兩只恒河猴（96.8出生）

1997.3.5臺灣地區吳明杰小組：5只克隆豬。

第五十七頁，共131頁。沃爾小組成功克隆兩只恒河猴返回第五十八頁，共131頁。吳明杰小組：5只克隆豬第五十九頁，共131頁。在日本克隆成功的牛返回第六十頁，共131頁。另一方面，人們馬上意識到克隆人的威脅。

政界紛紛出來表態。

1997.3.4（美）克林頓總統宣布：禁止聯邦政府資助人體克隆實驗。

1997.3.5（意）衛生部長在眾議院宣布：禁止人體和動物克隆。第六十一頁，共131頁。1997.3.11世界衛生組織（WHO）宣布：禁止人體克隆試驗。

1997.3.11歐盟委員會宣布：反對人體克隆試驗。

中國衛生部宣布：禁止人體克隆試驗。

第六十二頁，共131頁。一條科學成就的宣布，在全世界范圍內，在短短幾十天左右時間，從學術界到經濟界、政界引起巨大而深刻的反響，是空前的。

“克隆”一詞也頓時變得婦孺皆知。

第六十三頁，共131頁。二、從一個細胞到一只羊

所有有性繁殖的生物，都是從一個受精卵發育到完整的生物體。

第六十四頁，共131頁。嬰兒1012個細胞成人1014個細胞(1克肝或胃，由2.5－3億個細胞組成。)人體總共有200多種細胞類型。返回第六十五頁，共131頁。1、細胞分化

在個體發育中，細胞后代在形態結構和功能上發生差異的過程，稱為細胞分化。第六十六頁，共131頁。

2、細胞的發育潛能

由一個細胞可能分化發育出多少種細胞？這就是細胞的發育潛能。

大致有三種不同的發育潛能。第六十七頁，共131頁。全能性——具有能使后代細胞形成完整個體的潛能的細胞稱全能性細胞。例如：受精卵第六十八頁，共131頁。卵受精過程返回精子正在穿越卵子外膜核融合第六十九頁，共131頁。

多能性——

具有分化出多種組織或細胞（但是不能形成完整個體）的潛能的細胞稱多能性細胞。

例如，生血多能干細胞

第七十頁，共131頁。從多能生血干細胞可以分化發育出許多種血細胞。第七十一頁，共131頁。返回使研究者可以分辨出脾臟克隆分析法骨髓來源的不同的前體細胞。第七十二頁，共131頁。

單能性——

只能分化成一種細胞的干細胞稱單能干細胞。

例如，單能生血干細胞第七十三頁，共131頁。返回多能生血干細胞單能生血干細胞第七十四頁，共131頁。3、對于植物來說，分化成熟的植物細胞體，仍保持全能性，仍有可能發育成完整植株。

第一例從一個植物體細胞

一棵植株的實驗。

第七十五頁，共131頁。無性繁殖楊柳插枝繁殖

山芋塊根繁殖

馬鈴薯塊莖繁殖

這些都還不是嚴格意義上的一個體細胞一棵植株

返回第七十六頁，共131頁。從單個細胞到愈傷組織到整個植株胡蘿卜第七十七頁，共131頁。返回從植物體細胞到一棵完整的植株植物體細胞具有全能性第七十八頁，共131頁。對于動物來說：

隨著分化的演進，細胞逐漸喪失其分化潛能。

全能性多能性單能性分化成熟的體細胞。

實際上，動物細胞喪失全能性的過程，開始得很早。

第七十九頁，共131頁。人類生產四胞胎的幾率為1/7x105新千年上海首例四胞胎誕生返回第八十頁，共131頁。4、分化成熟的動物細胞已失去全能性。不可能發育成為完整的動物個體。原因何在？

陸續出現一些探索動物細胞全能性喪失原因的實驗。

第八十一頁，共131頁。1952豹蛙

囊胚細胞核去核卵母細胞

蝌蚪

可育的蛙

爪蟾：腸上皮細胞核仍保持全能性第八十二頁，共131頁。爪蟾的核移植實驗第八十三頁，共131頁。爪蟾：腸上皮細胞核仍保持全能性返回第八十四頁，共131頁。

1978黑斑蛙(童第周)

蛙紅細胞核去核未受精卵細胞

蝌蚪

第八十五頁，共131頁。1981克隆小鼠的實驗

第八十六頁，共131頁。Illmensee&Hoppe的克隆小鼠實驗細胞核受體細胞核供體收集受精卵去核融合甲品種小鼠乙品種小鼠收集囊胚期細胞團分散成單細胞取核融合第八十七頁，共131頁。將核注入已去核的受精卵中在培養皿中培養至細胞團植入假母子宮產出小鼠核移植小鼠（克隆小鼠）長成成鼠，呈核供體小鼠性狀返回第八十八頁，共131頁。

以上實驗得出的結論

囊胚階段的細胞乃至成熟的體細胞，其細胞核仍具有全能性——可能發育成完整個體。

細胞核保持著全套基因組。

第八十九頁，共131頁。看來，關鍵在于細胞質。細胞質中有著決定細胞分化全能性的物質，稱為分化決定子。

第九十頁，共131頁。后來實驗證明，細胞質中的分化決定子，是RNA。它們對紫外線敏感，對RNase敏感。

在卵子形成過程中，卵母細胞中含有2－5萬種mRNA，每種約600個拷貝。這些RNA構成母體信息，決定受精卵的發育潛能。

第九十一頁，共131頁。信息體（informasome）

在卵子中，母體信息以核糖核酸蛋白（RNP）顆粒形式存在，其沉降系數比核糖體還大，稱為信息體。

返回第九十二頁，共131頁。到1980s初，克隆實驗已用小鼠取得成功。

囊胚細胞核＋去核受精卵

那么，為什么1990s底多利羊實驗成功仍會引起這么大的震動？

第九十三頁，共131頁。從囊胚細胞核到分化成熟的體細

胞核是一個大進步。

從實驗小鼠到羊，也有所不同。

最重要的是時機：1980s初到

1990s末。

返回第九十四頁，共131頁。三、多利羊實驗的設計和實施

1、實驗過程嚴密的實驗設計精心的操作過程嚴格的結果檢驗第九十五頁，共131頁。實驗過程細胞核受體

ScottishBlackfaceewe細胞核供體注射促性腺激素釋放激素經28-33h排卵DolldorsetBlackWleshFinnDorseteweeweMountain9天胚26天胎羊6歲母羊孕期最后三個月胚細胞胎羊細胞乳腺細胞培養于0.5%胎牛血清培養基中，使從生長周期中出來停頓于G。34~36h取出核第九十六頁，共131頁。分別進行培養在羊輸卵管上6天，分裂成長至桑椹期或囊胚期細胞融合移入假母（蘇格蘭黑臉母羊）子宮,1~3胚/頭假母第九十七頁，共131頁。第九十八頁，共131頁。50~60天，超聲檢查，21頭胎羊，以后每14天查一次。最后產出八頭小羊分屬三個核供體來源。

胎羊丟失率：62%（13頭）以形態特征，DNAmicrosatelliteanalysis

產出小羊均顯示供體羊特征返回第九十九頁，共131頁。2、實驗成功的關鍵，血清饑餓

使細胞核和去核卵細胞處于細胞周

期中相匹配的階段。

使結合在基因（DNA）上的調控

蛋白脫落下來。

重新編程（repreogram,remodel）第一百頁，共131頁。返回第一百零一頁，共131頁。

對多利羊實驗的質疑。

質疑：來自乳腺的細胞究竟是不是分化成熟的體細胞？(原來供細胞的母羊已死)

回答：在Nature原文中已說明，懷孕期間胚胎細胞可能進入母體，1/106可能性。需要進一步實驗。

第一百零二頁，共131頁。

四、多利羊實驗的理論意義和實

踐意義

1、理論意義

證實分化成熟的動物細胞核仍具全能性。

證實細胞質對胚胎發育分化的決定性。

第一百零三頁，共131頁。2、實踐意義

蛋白質－多肽類藥物

(胰島素、凝血因子、干擾素、生長因子)

目前年產（1998）76億美元

2000年產185億美元第一百零四頁，共131頁。80年代初期到九十年代初期這10年內基因工程用于生產蛋白質—多肽類藥物有很大發展。細菌、酵母表達系統——糖修飾、蛋白質折疊。動物細胞培養——太貴、成本高。轉基因動物——亦已成功。第一百零五頁，共131頁。轉基因動物提高了蛋白質——肽類藥物的產量產量細胞培養法5%轉基因羊羊奶中25%—50%英國羅斯林研究所和PPL制藥公司聯合，50只轉基因羊，已傳四代。希望用克隆法生產4000只基因工程奶羊。第一百零六頁，共131頁。

乳腺生物反應器

荷蘭生產EPO的轉基因牛年產值40億美元

英國生產-胰蛋白酶一杯羊奶6000美元

制劑的轉基因羊

中國

中科院發育所合作1998年6月得到兩只體細

揚州大學胞克隆羊，能分泌乳腺藥物

第一百零七頁，共131頁。問題是：所得到的轉基因動物在有性生殖過程中，容易丟失轉入的基因和特性。對克隆（無性生殖）大動物有了強烈的客觀需求。

第一百零八頁，共131頁。

器官移植：

角膜皮膚

腎肝

肺心臟等等

器官移植大量開展需要大量供體器官。人體器官的代用品來自豬。

第一百零九頁，共131頁。獲得供器官移植的純種豬需要：

去掉豬抗原性

移入人抗凝血因子

近交20代約需20年克隆技術使純種豬培育時間大為縮短。第一百一十頁，共131頁。人類疾病的動物模型動物模型對于研究疾病機理試驗新藥等方面的實驗不可缺少。第一百一十一頁，共131頁。試驗抗免疫排斥藥物。試驗抗艾滋病毒藥物。裸鼠遺傳上胸腺缺失，不產生有功能的T－細胞。把人胚胎胸腺移入裸鼠，成為“類人鼠”。返回第一百一十二頁，共131頁。

珍稀瀕危動物繁殖

克隆大熊貓實驗已開始

據報道，將大象胚胎移入小鼠體內已獲成功。

第一百一十三頁，共131頁。動物育種

克隆技術用于動物育種可以極大地加快育種的速度。

第一百一十四頁，共131頁。警惕一種危險。克隆產生的后代，基因組成單一，失去對復雜環境變化的適應潛力。第一百一十五頁，共131頁。返回美洲豹被認為基因組成過于單一，有面臨種群滅絕的危險。第一百一十六頁，共131頁。

五、多利羊實驗帶來的困惑——

倫理學問題

倫理學:在人類社會長期生活中逐漸形成的有關人們相互關系的共識。第一百一十七頁，共131頁。1、克隆人問題

不可能通過克隆得到完全相同

的成年人。

社會上最初反應：共識—禁止

克隆人實驗。

但是，經過兩年后，克隆人實驗的呼聲漸高。第一百一十八頁，共131頁。人們反對克隆人實驗的示威返回第一百一十九頁，共131頁。

芝加哥理查德錫德于1998年1月宣布:

要組成一個小組，做克隆人實驗。

1.5年內完成第一個克隆人。

再用1.5年完成500個克隆人。

第一百二十頁，共131頁。反響一：幾天后克林頓要求國會立法，

加以阻止。

反響二：加州等許多州通過立法:

對克隆人實驗處以

25－100萬美金