第10章合子胚培養1合子胚培養的概念1.1植物胚胎培養的概念植物胚胎培養是指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳進行離體培養，使其發育成完整植株的技術。

1.2合子胚培養的概念合子胚培養是指在無菌條件下分離和培養有性胚，以期獲得可育植株的一種技術。1904年，Hannig最早在無菌條件下進行了離體胚培養實驗（辣根菜和胡蘿卜的成熟胚）。依靠合子胚培養技術，現在已經能夠挽救早熟敗育的雜種胚。

2胚培養的類型2.1成熟胚培養培養基和培養條件：培養基只需含無機鹽和糖即可；提供合適的生長條件及打破休眠。培養技術：成熟胚培養技術也要求不嚴操作：受精后的果實或種子（帶種皮）表面消毒剝離種胚培養完整植株。發育途徑：主要是直接形成幼苗2.2幼胚（未成熟胚）培養幼胚指的是尚未成熟即發育早期的胚。特點：培養困難，對培養基的要求復雜對培養技術和培養條件的要求較高幼胚培養發育途徑：（1）繼續正常的胚胎發育過程，維持胚性生長，最終形成具有萌發能力的成熟胚。進行幼胚培養時，關鍵是維持胚性生長（此途徑為需要途徑）。為了保證離體幼胚能沿著胚胎發生的途徑發育，其對營養的需求較成熟胚復雜。（2）不能維持胚性生長，迅速萌發為幼苗。幼胚未經完成正常的胚胎發育過程而形成幼苗的現象稱為“早熟萌發”(precociousgermination，不需要)。（3）形成愈傷組織。若形成愈傷組織，愈傷組織可再分化形成植株。3合子胚培養的技術措施3.1材料的選擇與滅菌（p157）（1）幼胚培養

選材：因植物類型及實驗目的的不同而不同表面消毒：對受精后子房進行表面消毒（2）成熟胚培養：取成熟的果實或種子進行表面消毒，再分離胚進行和培養。3.2胚的分離及培養3.2.1胚的分離成熟胚的剝離：較容易幼胚的剝離（p157～158）：表面消毒切開子房壁取出胚珠剝離珠被取出完整幼胚培養3.2.2胚的培養成熟胚的培養：只需提供合適的生長條件及打破休眠，即可在比較簡單的培養基上萌發生長，形成幼苗。故培養基只需含無機鹽和糖即可。另外，成熟胚培養技術也要求不嚴。未成熟胚的培養：要求的技術和條件較高。胚胎發育過程可分為兩個時期：異養期和自養期。胚由異養轉入自養是其發育的關鍵時期。在這兩個時期之內，培養中的胚對外源營養的要求隨胚齡的增加而逐漸趨向簡單（p153，表9.1）。在人工培養基上幼胚培養難成功，利用胚乳看護培養（為什么？），可顯著提高幼胚的成活率。可用同種胚乳，也可用異種胚乳（p159）。4影響胚培養的因素4.1培養基4.1.1無機鹽用于胚培養的無機鹽配方很多，對其中每種成分的作用并無精確的評價。

成熟胚培養中，主要采用一些較簡單的培養基，如Tukey、Randolph、White等。幼胚培養的培養基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。根據Monnier(1976)的研究，在一定的培養基上，未成熟胚的生長和存活之間并不存在相關性（p161，圖9.4），并設計了新的培養基（p154～155，表9.3）。另據Umbeck和Norstog(1979)報道，培養基中的NH4＋對于大麥未成熟胚的正常生長和分化是必需的。4.1.2碳水化合物和培養基的滲透壓種類：蔗糖最好濃度：因胚的發育時期而有所不同。成熟胚在含2％蔗糖的培養基中就能很好生長；幼胚則要求較高水平的糖濃度（一般為8％～12％），如果濃度過低，會引起幼胚過早萌發。在長期的培養過程中，隨著培養時間的增加，必須把胚轉移到蔗糖水平逐步降低的培養基中。蔗糖不僅是作為一種能源，而且是為了保持適當的滲透壓，后者對于未成熟胚的培養來說尤為重要。

另有觀點認為，胚在離體條件下的生長和分化在很大程度上并不依賴于滲透壓的大小，而主要取決于某些生長調節物質的存在與否。4.1.3氨基酸和維生素在胚培養中加入氨基酸，無論是單一的還是復合的，都能刺激胚的生長。加單一氨基酸時，以谷氨酰胺最有效。水解酪蛋白(CH)是一種氨基酸復合物，一直被廣泛用于胚培養。胚對水解酪蛋白的敏感性因物種而異。常用于胚培養的維生素類有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。維生素對發育初期的幼胚培養是必需的，但對已萌發生長的胚，可能對其形態發生有抑制作用。

4.1.4植物生長調節劑除了在某些植物中為了打破休眠以外，沒有證據表明離體的成熟或未成熟胚的正常發育需要外源生長調節物質。實際上，生長素對于胚的生長通常表現抑制作用。如果為了由胚和胚段誘導愈傷組織，則通常都須在培養基中加入生長素或細胞分裂素，或二者都加。4.1.5天然有機物正常植物體上，胚的生長受胚乳滋養，因此，加入一些天然的胚乳或種子提取物，對離體胚的生長有促進作用。某一植物的胚乳組織提取物對該植物胚的生長較好。

其它如椰子汁、番茄汁等有較好效果。4.1.6培養基的pH培養基的pH對胚的培養也有一定的影響。例子：如薺菜離體胚在pH值為5.4～7.5的培養基中都能正常生長。對紫花曼陀羅心形早期的胚培養最適pH值在5.0～7.5的范圍內。8日齡的水稻胚在pH值5和9時，生長最好。Norstog和Smith(1963)報道，培養基的pH值對于大麥未成熟胚的器官分化是關鍵因素，最適值約為4.9。4.2培養條件4.2.1溫度大多數植物胚培養的溫度為25～30℃，但也有些植物需要較低或較高的溫度。如：馬鈴薯：20℃；香子蘭(Vanillafragrans)：32～34℃；柑橘、蘋果、梨：25～30℃；棉花：32℃；桃：胚培養需在變溫條件下進行4.2.2光照由于胚在胚珠內的發育是不見光的，所以一般認為在黑暗或弱光下培養幼胚比較適宜，光對胚胎發育有輕微的抑制作用。離體培養條件下進一步發育的幼胚對光的需求，因植物種類而異。4.3胚柄胚柄的形態結構：p158，圖9.1有關胚柄的結構、細胞學和生理生化的詳細研究表明，胚柄積極參與幼胚的發育過程。有研究指出在幼胚培養中，胚柄的存在對幼胚的存活是關鍵。使用生長調節物質，如5mg／L赤霉素能有效地取代胚柄的作用。當沒有胚柄存在時，一定濃度范圍的KT可促進幼胚的生長，但其作用難與赤霉素相比。但Monnier(1978)的觀點是，無胚柄的極幼齡胚所以難于培養，是由于在除掉胚柄時所引起的損傷造成的。5胚培養的應用5.1通過“胚拯救”獲得遠緣雜種通過“胚拯救”即可克服這種受精后障礙，產生遠緣雜種?！芭哒取钡姆绞接腥N：5.1.1雜種幼胚在人工培養基上培養在發生“受精后障礙”的情況下，若把雜種胚在開始夭折之前剝離出來，置于一種適當的人工培養基上培養，則雜種胚常常表現出正常生長的潛力，最終長成雜種植株（p172）。例子：草木犀、百合、車軸草屬、稻屬植物、番茄等如果胚的夭折發生在發育的極早期，由于人工培養基很難取代天然胚乳的作用，采用以上方法拯救雜種仍會遇到很大困難，在這種情況下，則可嘗試胚乳看護培養法（p172～173）。5.1.2雜種幼胚的胚乳看護培養在以上兩種方法皆難奏效的情況下，則可嘗試雜種幼胚愈傷組織培養法，即先把雜種幼胚誘導成愈傷組織，經過或長或短的繼代培養之后，再誘導雜種愈傷組織分化植株（p173）。5.1.3雜種幼胚的愈傷組織培養步驟：有性雜交雜種幼胚培養雜種愈傷組織形成愈傷組織增殖莖芽分化植株再生例子：小麥×簇毛麥、大麥×小麥、栽培番茄×智利番茄等5.2獲得單倍體在遠緣雜交之后，通過染色體的定向消除而產生單倍體，是胚培養的另一項新用途（p175）。例子：栽培大麥×球莖大麥5.3打破種子休眠，縮短育種周期許多植物的種子發育不完全或有抑制物存在而影響種胚發芽。而通過幼胚培養，可促使這些植物的幼胚達到生理和形態上的成熟而提早萌發，形成植株。

在有些情況下，園藝植物如落葉樹的育種工作，會因種子休眠期太長而延誤。通過胚的離體培養，可使休眠期縮短（p176）。

5.4提高種子萌發率，繁殖稀有物種長期營養繁殖的植物具有形成種子的能力，但其生活力較