重組DNA技術中心法則編碼鏈，有意義鏈，Crick鏈轉錄翻譯重組DNA技術的基本步驟

基因克隆的載體載體的作用是容納被克隆的目標基因，以便將它們帶入到特定的宿主細胞中進行擴增或表達。一種理想的載體至少滿足以下幾個條件：（1）大多數載體含有原核細胞DNA復制起始區，以便于在原核系統中的擴增；（2）某些載體還含有真核細胞DNA復制起始區，以方便在真核細胞內的自主復制；（3）含有集中了多種常用的限制性內切酶切點的多克隆位點，以方便各種克隆片段的插入和建立DNA文庫；（4）帶有抗生素抗性基因或其它選擇性標記，有利于克隆的篩選和鑒別；目前使用的載體多衍生于質粒、噬菌體和病毒。pUC18/19質粒的基本結構λ噬菌體載體的構建、重組和包裝細菌人工染色體的結構和外源DNA的插入酵母人工染色體的結構和外源DNA的插入將外源基因或序列導入載體的工具將外源基因或序列導入到載體需要特殊的工具酶，其中以限制性內切酶（RE）和連接酶最為重要，此外，有時還需要DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸酶等。限制性內切酶限制性內切酶實際上是一類特殊的具有高度位點特異性的DNA內切酶，它們識別雙鏈DNA分子內部特殊的堿基序列（通常為4bp~6bp的回文序列），切開DNA的兩條鏈，產生特定的末端。限制性內切酶的命名是按照酶的來源菌的屬名和種名而定，由屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母縮寫而成。如有菌株名，再加上一個字母，其后再按發現的次序添上羅馬數字。例如，第一種限制性內切酶是在大腸桿菌RY13（E.coliRY13）被發現的，按照上述規則，它被命名為EcoRI。已發現三種類型的限制性內切酶，它們在組成、與修飾酶活性關系和切割性質上有如下差別：（1）Ⅰ類限制性核酸內切酶：由3種不同的亞基組成，兼有修飾酶和依賴于ATP的內切酶活性，它能識別和結合于特定的DNA序列位點，但隨機切斷在識別位點以外的DNA序列（通常在識別位點周圍400bp~700bp）。這類酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2）Ⅱ類限制性核酸內切酶：不具有修飾酶活性，只由一條肽鏈組成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特異性最強，且在識別位點內部切斷DNA，93%的限制性內切酶屬于此類；（3）Ⅲ類限制性核酸內切酶與Ⅰ類酶相似，需要Mg2+和ATP，但切點在識別序列周圍25bp~30bp范圍內。顯然，II類限制性內切酶最適合于基因克隆，通常在重組DNA技術中提到的限制性內切酶都屬于此類。II類限制性內切酶的三種切割方式常見的幾種RE識別的堿基序列和切點性質

不同類型的限制性內切酶的切點性質以及粘端之間的退火宿主細胞宿主細胞是接受、擴增和表達重組DNA的場所。理論上，任何活細胞都可以作為宿主細胞，但最為常用的宿主細胞有大腸桿菌、酵母、草地貪夜蛾的培養細胞和哺乳動物的培養細胞等。大腸桿菌是最常用的原核宿主菌，原因是對它比較了解，操作起來也特別容易。酵母是最常用的真核宿主細胞，其很多性質與大腸桿菌相似；草地貪夜蛾的培養細胞專門用來接受改造過的昆蟲桿狀病毒載體。將重組DNA引入到宿主細胞的途徑轉化轉染電穿孔脂質體介導彈道基因轉移重組體的選擇和篩選

直接篩選1.根據抗生素敏感性和抗性變化進行篩選2.根據營養需要進行篩選3.根據噬菌斑類型進行篩選4.藍白斑選擇間接篩選1.核酸雜交法2.PCR法3.免疫化學4.受體/配體的結合性質5.Southwestern/Northwestern6.DNA限制性內切酶圖譜分析7.DNA序列分析藍白篩選法圖解基因克隆的詳細步驟獲得外源DNA序列和目的基因；將目的基因與載體相連；將重組體導入特定的宿主細胞；目的基因序列克隆的篩選與鑒定。獲取目的基因的手段人工合成使用酶切將目的基因直接從另一種克隆載體中釋放出來反轉錄PCR目的基因與載體的連接將外源序列或目的基因插入載體，主要是靠DNA連接酶和其它工具酶的配合使用。根據末端的性質，它們的連接方式主要有三種：（1）載體和目的基因具有相同的粘性末端；（2）載體和目的基因均為平端；（3）載體和目的基因各有一個粘性末端和一個平端。選擇哪一種連接方式主要取決于載體的性質（特別是MCS的性質）和目的基因的來源。基因克隆的應用文庫建立序列分析表達外源蛋白制備轉基因動物和植物基因治療基因敲除尋找未知基因。文庫的建立基因克隆中的文庫是指克隆到某種載體上能夠代表所有可能序列并且可以穩定維持和使用的DNA片段的集合。根據序列的來源，文庫可分為基因組文庫和cDNA文庫。建立文庫的主要目的在于使用合適的方法，從文庫中鑒定出特定的目的序列，并進行擴增分離，此過程被稱為文庫篩選；也可以在鳥槍序列分析中，隨機選擇一個克隆對其進行鑒定。基因組文庫的構建cDNA文庫的構建cDNA的合成和cDNA文庫的構建克隆基因在宿主細胞中的表達要使克隆基因在宿主細胞中表達，首先需要將目的基因亞克隆到帶有基因表達所必需的各種元件的載體之中，這些載體通稱為表達載體。目的基因可以放在不同的宿主細胞中表達。針對不同的表達系統，需要構建不同的表達載體。表達載體可分為融合載體和非融合載體兩類，前者在插入位點上“預裝”了另外一個蛋白質或多肽的基因，因此，插入的外源基因將會與它發生融合，表達出來的是一種融合蛋白。使用融合載體的主要好處是方便了目的蛋白的純化。理想的表達系統應該滿足以下條件：（1）表達載體具有合適的MCS，以便使外源基因能夠插入到正確的表達位置，或者至少是含有3個以上閱讀框架的系列；（2）能夠形成正確的翻譯后修飾和三維結構，以形成有活性的或有功能的分子；（3）為可誘導的表達系統，允許細胞生長和誘導表達，防止毒性蛋白質的積累；（4）易于分離和純化；（5）最好能分泌到胞外。胰島素在大腸桿菌體內的表達凝血因子VIII高表達載體的構建和及其原理培育轉基因動物的基本步驟準備供體動物，分離受精卵；準備注射用轉基因DNA溶液；將轉基因DNA顯微注射到一個受精卵的雌性原核之中，進入的DNA通過非同源重組插入到基因組之中；將受精卵移植到代孕母鼠的子宮之中；對出生的小鼠進行篩選，挑出轉基因小鼠。基因治療基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞，表達有功能的蛋白質，以糾正目的基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治病目的的一種治療方法。根據治療的細胞對象，基因治療分為性細胞基因治療和體細胞基因治療兩種類型。性細胞基因治療，是在患者的性細胞中進行操作，用來徹底根除并使其后代從此再也不會得這種遺傳疾病。然而，由于目前的技術水平有限，難以解決關鍵的基因定點整合（或稱基因打靶）問題，加之相關的倫理學問題，以及愿意接受治療的志愿患者甚少，還不能進入臨床試驗。體細胞基因治療才是當今基因治療研究的主流。根據治療途徑，基因治療可分為體內基因治療和回體基因治療。基因敲除基因敲除是上個世紀80年代后半期隨DNA同源重組原理發展起來的一門新技術，它是指在分子水平上，使用特定的手段，將一個結構已知但功能不詳的基因去除，或用其它順序相近的基因取代，使原基因功能喪失，然后從整體觀察實驗動物的表型變化，進而推斷相應基因的功能。這與早期生理學研究中常用的切除部分-觀察整體-推測功能的思路相似。聚合酶鏈式反應（PCR）聚合酶鏈式反應是由美國科學家KaryMullis于1984年發明的一種簡單、快速、靈敏和應用廣泛的在體外選擇和特異性擴增特定DNA序列或片段的方法。PCR的原理并不復雜：理論上，DNA分子數目經復制呈指數增長，如果提供足夠的引物和dNTPs，1分子DNA復制n次后，可產生2n個DNA分子。但與體內DNA復制不一樣的是：PCR的解鏈反應使用的是熱變性，而不是解鏈酶；PCR使用的引物是人工合成寡聚DNA，而不是像體內由引發酶合成的RNA；為了增加DNA聚合酶的穩定性，PCR使用的是耐熱的DNA聚合酶。整個PCR反應由多個循環組成（循環次數為30次~40次），每循環一次，DNA復制一次。每一個循環由三步反應組成：（1）DNA變性—采取熱變性，使模板DNA在95℃左右的高溫下解鏈；（2）退火—降低溫度（通常在50℃–65℃），以使引物與模板DNA配對；（3）延伸反應—在DNA聚合酶催化下的，在引物的3′-端合成DNA，溫度通常在72℃左右。聚合酶鏈式反應的基本過程蛋白質工程蛋白質工程就是使用遺傳和化學手段，從改變或合成基因入手，改變一種蛋白質的結構與功能，從而產生具有特殊的、符合人們意愿性質的新產物的一項技術。它是在基因工程基礎上綜合蛋白質化學、蛋白質晶體學、計算機學輔助設計等知識和技術發展起來的研究新領域，開創了按人類意愿改造和設計人類需要的蛋白質的新時代，在技術方面有諸多同基因工程技術相似的地方，因此蛋白質工程也被稱為第二代基因工程。蛋白質工程一般有三個目的：（1）改變催化性質。這包括提高Vmax、降低Km值、改變最適pH、去除抑制劑作用位點、改變反應的特異性或去除導致蛋白質不穩定的氨基酸殘基等；（2）改變結構性質。這包括改善熱穩定性、提高在有機溶劑中的穩定性、改變理化性質或改變對配體結合的特異性；（3）創造新系統。這包括合成融合蛋白或多功能蛋白、添加有利于純化的標記或增強藥用蛋白質的藥效。改造蛋白質的主要手段是體外突變。突變分為特異性突變和非特異性突變。基因芯片基因芯片是隨著“人類基因組計劃”和其它模式生物基因組計劃的進展而發展起來一門新技術，也叫DNA芯片、DNA微陣列或寡核苷酸陣列，它采用原位合成或顯微打印手段，將數以萬計的DNA探針固定在支持物表面上，產生二維DNA探針陣列，然后，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱，對生物樣品進行快速、并行和高效地檢測或醫學診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術，所以稱之為基因芯片技術。基因芯片以其無可比擬的信息量、高通量、快速和準確地分析基因的本領，在基因組功能研究、臨床診斷及新藥開發等方面顯示出巨大的威力，已成為人類研究和維護生命的一大利器，因此，被譽為是基因功能研究領域最偉大的發明之一。一般說來應用基因芯片分