抗體檢測技術免疫酶技術免疫熒光技術凝集反應沉淀反應補體結合試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

抗體檢測技術1凝集反應

凝集反應是指顆?？乖c相應抗體結合反應出現的可見性現象。顆?？乖缤暾募毦?、紅細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現凝集。凝集反應中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集反應凝集反應是指顆粒抗原與相應抗體結合反應出現的可見性2沉淀反應1、絮狀沉淀反應2、環狀沉淀反應3、雙向擴散4、單向免疫擴散沉淀反應1、絮狀沉淀反應3雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在4抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現的沉淀弧有多條，彼此互不干擾?？乖贵w為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：5

酶聯免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

酶聯免疫吸附測定實驗

6實驗原理ELISA利用了免疫反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進行抗原抗體反應加底物顯色，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析實驗原理ELISA利用了免疫反應的高度特異性7方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據試劑來源、標本性狀以及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法方法類型ELISA既可測抗原又可測抗體，8抗體檢測技術課件9抗體檢測技術課件10抗體檢測技術課件11AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.AsandwichELISA.(1)Plateis12一、試劑及儀器準備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強②能保持Ag或Ab活性③不參與化學反應

一、試劑及儀器準備13⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應板⑵載體性能比較142.Ag或Ab：純度高、效價高、結合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾2.Ag或Ab：純度高、效價高、結合力高15㈡酶結合物：1.要求：純度高、催化轉化率高、專一性強、性質穩定、來源豐富、標記后穩定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯苯胺(TMB)：藍色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光㈡酶結合物：164.酶結合物的制備：戊二醛交聯法過碘酸鹽氧化法4.酶結合物的制備：17（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計性能指標：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性優良的酶標儀的讀數一般可精確0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30min，測讀結果更穩定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀18抗體檢測技術課件19用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces用途DrDennisEBidwellandAlis20WESTERNBLOT步驟：試劑準備：1、SDS試劑:見電泳實驗。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

WESTERNBLOT步驟：21樣品制備含量測定樣品制備22SDS－PAGE電泳SDS－PAGE電泳23轉膜轉膜24免疫反應免疫反應25化學發光化學發光26類風濕因子類風濕因子（rheumatoidfactor,RF）可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在臨床內科學中描述為四型，沒有IgD型；但在實驗室診斷學中描述為5型），是類風濕關節炎血清中針對IgGFC片段上抗原表位的一類自身抗體，類風濕因子陽性患者較多伴有關節外表現，如皮下結節及血管炎等。類風濕因子類風濕因子（rheumatoidfactor,R27類風濕因子約90%類風濕性關節炎（RA）患者的RF呈陽性。IgA-RF與骨質破壞有關，早期IgA-RF升高常提示病情嚴重，預后不良；IgE-RF升高時，已屬病情晚期。某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等患者都有較高的陽性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現RF。類風濕因子約90%類風濕性關節炎（RA）患者的RF呈陽性。28類風濕因子近年來對IgM型類風濕因子的生物作用已有所了解，這些生物作用包括：1、調節體內免疫反應；2、激活補體，加快清除微生物感染；3、清除免疫復合物使機體免受循環復合物的損傷。類風濕因子近年來對IgM型類風濕因子的生物作用已有所了解，這29類風濕因子測定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間接法，即用熱凝集兔IgG包被反應板微孔，加入檢樣后，再分別加抗人IgG、IgA、IgM酶標記抗體，使反應后再與底物呈色。為防止各Ig類別RF相互干擾，酶標記抗體使用標記的抗體F（ab）2片段。類風濕因子測定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間30類風濕因子RF因子濃度的檢測對自身免疫性疾病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、結締組織病、硬皮病等的診斷治療和預后有重要的指導意義。另外，在慢性炎性反應性疾病中，因炎性反應對免疫系統造成的長期反復的刺激，引起免疫系統紊亂，也可導致RF濃度的升高，如慢性活動性肝炎患者等。類風濕因子RF因子濃度的檢測對自身免疫性疾病如類風濕性關節炎31抗體檢測技術免疫酶技術免疫熒光技術凝集反應沉淀反應補體結合試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

抗體檢測技術32凝集反應

凝集反應是指顆粒抗原與相應抗體結合反應出現的可見性現象。顆?？乖缤暾募毦?、紅細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現凝集。凝集反應中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集反應凝集反應是指顆粒抗原與相應抗體結合反應出現的可見性33沉淀反應1、絮狀沉淀反應2、環狀沉淀反應3、雙向擴散4、單向免疫擴散沉淀反應1、絮狀沉淀反應34雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在35抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：36

酶聯免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

酶聯免疫吸附測定實驗

37實驗原理ELISA利用了免疫反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進行抗原抗體反應加底物顯色，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析實驗原理ELISA利用了免疫反應的高度特異性38方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據試劑來源、標本性狀以及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法方法類型ELISA既可測抗原又可測抗體，39抗體檢測技術課件40抗體檢測技術課件41抗體檢測技術課件42AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.AsandwichELISA.(1)Plateis43一、試劑及儀器準備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強②能保持Ag或Ab活性③不參與化學反應

一、試劑及儀器準備44⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應板⑵載體性能比較452.Ag或Ab：純度高、效價高、結合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾2.Ag或Ab：純度高、效價高、結合力高46㈡酶結合物：1.要求：純度高、催化轉化率高、專一性強、性質穩定、來源豐富、標記后穩定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯苯胺(TMB)：藍色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光㈡酶結合物：474.酶結合物的制備：戊二醛交聯法過碘酸鹽氧化法4.酶結合物的制備：48（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計性能指標：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性優良的酶標儀的讀數一般可精確0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30min，測讀結果更穩定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀49抗體檢測技術課件50用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces用途DrDennisEBidwellandAlis51WESTERNBLOT步驟：試劑準備：1、SDS試劑:見電泳實驗。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

WESTERNBLOT步驟：52樣品制備含量測定樣品制備53SDS－PAGE電泳SDS－PAGE電泳54轉膜轉膜55免疫反應免疫反應56化學發光化學發光57類