化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aeruginosa）

的檢測目的：

1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。2.掌握幾種培養基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。原理：

銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm～3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態。氧化酶陽性，能產生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產生氮氣，在42℃條件下可以生長，可與類似菌區別。操作步驟

檢樣前化妝品的處理

接樣于營養肉湯增菌，37℃，12h，140rpm培養分離培養，挑取培養物接于十六烷基三甲基溴化銨平板，37℃，18-24h

染色鏡檢

配十六烷基三甲基溴化銨培養基（選擇性培養基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制）配綠膿菌素測定用培養基，明膠培養基，硝酸鹽蛋白胨水培養基，普通瓊脂斜面培養基實驗一培養基的制備及細菌的分離培養

實驗目的掌握培養基制備的原理和方法掌握細菌的分離培養了解滅菌方法實驗原理

不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養條件，在實驗室中，微生物的營養是由培養基來提供的。培養基是按照微生物生長繁殖所需要的營養物質，用人工方法配制而成的營養基質。

除營養條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內才表現出最大生命力，因此，應針對不同的微生物將培養基的pH值調節到適當范圍。

操作步驟按培養基

配方稱量加水加

熱熔化調節

pH值分裝

包裝滅菌備用→注意事項培養基溶解時，加有瓊脂的培養基易沸，應注意看守。注意調節培養基的pH。稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。加熱后應補足液量。注意做好標記。方法：平板劃線法有幾種，可根據不同情況選用其中一種。(1)平行劃線法此法適用于含菌不多的液體標本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。①左手斜持平板底，右手持接種環。接種環在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環標本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。②將平板轉180°角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。將平板底放入蓋內，接種環火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養。實驗二染色鏡檢及五項指標試驗

革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢1．涂片：取一潔凈的載玻片，用記號筆在載玻片做好標記，并在載玻片中間滴一小滴生理..鹽水，以無菌接種環挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

為防止細菌濺散污染環境，接種環滅菌前，須先將接種環靠近火焰或放內焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細菌。2．干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。3．固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續通過三次，以固定之。此時殺死大部分細菌，并使標本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。4．染色：①初染:將結晶紫染液加于涂膜上，1min。②媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。③脫色：水洗后用95％乙醇脫色，并搖動玻片，直至流下的液體無色為止，約需0.5min。④復染：水洗后加石炭酸復紅稀釋液染色，1min。⑤水洗，用濾紙吸干，待標本充分干燥后進行鏡檢。5．鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。。

注意事項：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環節，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為好。被檢菌的培養條件、培養基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養物也有出現革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內。革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理鹽水接種環草酸銨結晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初染1min復染1min干燥

鏡檢

復紅氧化酶試驗原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細胞色素（reduced

cytochrome）氧化，產生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實驗有助于區分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidase

positive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科之細菌為氧化酵素陰性（oxidase

negative）。

方法：白色濾紙片取菌+1滴1%二甲基對苯二胺↓15~30s變紅色（+）不變色（-）實驗三

結果觀察及報告

明膠液化實驗：可疑菌落→穿刺接種于明膠培養基→37℃24h→取出放冰箱10~30min呈溶解狀為陽性，不溶解則為陰性。42℃生長實驗：可疑菌落→普通瓊脂斜面→42℃24h→銅綠假單胞菌生長，而近似的熒光假單胞菌不能生長。結果判斷

氧化酶（+）綠膿菌素（+）可報告檢出

典型或可疑菌落氧化酶（+）綠膿菌素（-）