【案例揭秘】通過色譜和紫外方法，使用體內數據建立并驗證一種有區分力的阿托伐他汀鈣片的溶生方法【案例揭秘】動態溶生測試法為難溶性藥物孟魯司特鈉魯司特鈉建立體內外相關性通過上述原版文獻資料的翻譯，各位同行對一些產品的體內外相關性有了一定的了解，今天給大家展示最新的本群同行的翻譯作品。歡迎各位同行一起來探討。原文由處見下面截圖第八季上海API群友會報名免費參加（點擊可跳轉）：第八季醫藥信息群友會第二輪通知（掃描二維碼報名）摘要：本文開發并驗證了一種通過參比制和中試批受試制劑（PB）的體內數據，分析阿托伐他汀鈣片溶生度的方法。在不同的溶劑和漏槽條件中進行實驗后，確定了合適的溶解度實驗條件，該條件為：漿法，50rmp,900ml的pH6.0的磷酸鉀緩沖液。參比制劑和受試制劑（PB）的體內溶由度數據通過生物等效性試驗獲得，吸收的劑量通過Loo-Riegelman法計算＜為了獲得A級的體內體外相關水平，需要在吸收和溶解的數據之間加入一個6.0的時間校正因子。根據美國藥典的相關規定，使用高效液相色譜法和紫外分光光度法對測量藥物溶由度的溶生方法進行了驗證。通過檢測不同中試批（PA和PB）和參比制劑的數據，評估了方法靈敏度。本文介紹的溶由度測試方法經過了驗證，可以在質量控制和新處方開發中作為一種有區分力的方法使用。簡介藥物體外溶由行為和體內藥代動力學數據之間的聯系，是生物藥劑學研究中的一項主要挑戰。體內體外相關性（IVIVC）被定義為藥品的生物學特性、或由生物學特性衍生生的參數，與同一劑型藥品的理化特性之間的關系。這個概念允許使用IVIVC作為人體藥代動力學研究的替代指標，在首次申報、生產規模改變以及上市后其他變更中減少生物等效性評估的樣本量。服用莫一劑型的藥品后，最常使用血藥濃度的曲線下面積（AUC）和最大血藥濃度（Cmax）等藥代動力學參數描述藥品生物學特性。最常使用的描述藥品理化特征的方法是體外的溶生行為。為了獲得IVIVC,生物學特性和理化特性間的關系常使用數學方式表達。應當使用有足夠靈敏度的方法測量固體制劑的體外溶由度，能夠區分由于處方比例和生產過程的顯著變化帶來的溶生行為差異。在制藥工業中，溶生度實驗是用以指導新處方開發、評估批間質量差異的一個非常重要的工具。在生物系統內，藥物在液體溶媒中的溶生，是系統吸收的重要先決條件。如果一個藥物有較低的溶生度，它在胃腸道中完全或部分溶生的速率，往往控制著藥品吸收的速度。IVIVC在藥物研發過程中可以用于溶生標準的制定、支持BE豁免。但是IVIVC的概念不適用于所有藥品，因此它對相關溶生方法的開發和制定有意義的產品標準造成了挑戰。根據生物藥劑學分類系統，阿托伐他汀屬于BCSII類（低溶解高滲透）藥品。對于BCSII類藥品，可能能夠通過溶生試驗預測體內的結果，因為溶生速率是影響吸收的主要限制因素。Palemetal.,Ahjel和Lupulesa,Narasaiah等人近些年已經開展了一些阿托伐他汀片溶生度的實驗。但是這些實驗主要評估不同處方之間的理化差異，缺乏對體內行為的研究。2004年，美國食品藥品監督管理局（FDA）發布了用于質量控制的溶生實驗條件，使用美國藥典方法2,轉速75rpm,緩沖液體系為pH6.8的50mM磷酸鉀緩沖液。本文的主要目的是開發并驗證一種可用于實驗室常規使用的、具有區分度的阿托伐他汀鈣片溶生方法，并根據體內模型闡述藥品的釋放過程。體外溶由數據與體內吸收的數據進行比較，體內的數據是通過巴西的參比制劑（RP）和仿制藥的一個中試批（PB）進行生物等效性試驗獲得的。使用HPLC和UV方法進行定量分析。實驗材料和方法實驗材料純度為99.85%的阿托伐他汀鈣標準物質，兩批用于測試的阿托伐他汀鈣片（PA和PB）,生物等效性試驗用到的RP和PB,以及相應的空白對照品。以上試劑都由當地的制藥公司提供。兩批中試產品的區別在于，PB中竣甲基纖維素鈉（崩解劑）的含量比PA高3%。參比制劑采購自當地市場，藥品商品名為Citalor?,規格80mg,批號0691060,體內體外試驗使用同一批號。HOLC級的乙睛和甲醇來自TEDIA公司(Fairfield,USA)。溶由介質和分析中使用的超純水由(Millipore?,Milfor,MA,USA)制備。其他所有化學制劑都為試劑級。阿托伐他汀鈣的HPLC定量和UV分析文獻調研顯示沒有特定的用于阿托伐他汀鈣溶生實驗的分析方法。因此我們根據ICH2005的要求，開發了一種HPLC測定的方法，用于初步的溶生度實驗研究。HPLC系統使用島津的工作站，包括LC-20AT的泵，SPD-M20A的光電二極管陣列(PDA)檢測器，CBM20A系統控制器，DGU-20A5脫氣機，CTO-20AC柱溫箱和SIL-20AC自動進樣器。使用LCsolution軟件獲取和處理數據。使用在25c下的RP-18柱(250X4.6mm;粒徑，5以m＞進行色譜分析，流動相由pH4.2乙酸鈉緩沖液：乙睛(45:55,v/v)的混合物組成，流速為1.0mL/min,注射體積為20以L。在245nm波長下進行檢測。使用的紫外-可見分光光度計型號為UV-1800,配備有1cm石英電池的雙光束(Shimadzu,Kyoto,Japan),光譜帶寬(1±0.2nm)波長精度為土0.1nm。使用島津UVProbe軟件2.33進行儀器控制，數據采集和分析。體內數據采用2X2的生物等效性試驗設計，每個周期中61名健康受試者服用試驗制劑或參比制劑。口服單劑量后，在3個半衰期的時間段內采集血液樣本，兩個周期之間最小間隔7個半衰期(清洗期)0RP和PB的藥代參數、各自的CV和IC90%見表一。體內數據通過Scientist?version2.0(MicroMath?)軟件進行非線性回歸方法分析。通過二室模型和相關參數計算中間血藥濃度。通過Loo-Riegelman方法計算藥物隨時間的吸收分數(fractionabsorbed,FA)。為了計算IVIVC,通過線性回歸分析的方法計算RP、PB的吸收分數(FA)和經溶生方法測得的溶由分數(dissolvedfraction,FD)。表I:RP和PB的藥代參數、CV和IC90%初步體外研究阿托伐他汀鈣溶解度測定首先進行阿托伐他汀鈣漏槽條件試驗，在不同的溶劑中，加入過量的阿托伐他汀鈣，散裝加入到管中，一式三份，溶劑體積10mL,37±0.5°條件下磁力震蕩24小時。溶劑包括：HCl(0.1M),pH1.2不含酶的胃液，pH3.0檸檬酸鹽緩沖液，pH4.0乙酸鹽緩沖液，pH5.0,6.0和6.8的磷酸鹽緩沖液，水。24小時后，將所有溶液3000rpm離心15分鐘，通過定量過濾器過濾。用甲醇/水(50:50v/v)按1:5比例稀釋，0.45以m尼龍膜過濾后通過LC法分析。溶由度儀和靈敏度使用VankelVK7010溶生度工作站(n=8)進行方法開發和驗證，該設備通過雙向蠕動泵連接VK8000自動取樣工作站。使用DM-20型數字式電位器(S?oPaulo,Brazil）用于測定所有緩沖溶液的pH值。所有溶生度條件的測試都在預先加熱到37±0.5的00mL溶液中進行。實驗考察了不同的轉速、緩沖液組成、以及漿法、籃法帶來的影響。分別在5,10,15,20,30,45,60,和120分鐘，由自動取樣器經35以m過濾器過濾后，抽取各條件下的溶液，用HPLC和UV的方法進行分析。為了評估哪種溶劑更有區分力，將不同時間點溶由和吸收分數的數值繪制成圖像，比較在預定的溶生條件下，哪種可以觀察到溶生度和體內吸收有最大的相似性。通過此步驟選曲的溶劑將用于后續的評估。RP和PB在不同條件中都進行了上述比較。溶由方法驗證根據現行的指導原則，進行了溶生方法的方法學驗證。考察參數包括專屬性、準確性、線性、精密度和耐用性，還對溶由介質的脫氣情況、過濾器對實驗的干擾以及穩定性進行了考察。專屬性通過用和RP具有相同處方的PB空白對照品進行專屬性評估。將對照品轉移至分離管中（n=3）,37±0.5°C條件下900mL溶劑溶解，并用美國藥典方法2以150rpm轉速攪拌90min。樣本過濾后使用HPLC和UV方法檢測。通過PDA進行峰純度檢測顯示由分析物的色譜峰只包含一種物質。在200-400nm波長范圍內掃描，對經溶生介質稀釋后的標準溶液和空白對照品溶液進行UV分析。線性采用合適的溶劑做稀釋的情況下，HPLC方法的線性范圍為10.0-175.0以g/mLUV法線性范圍1.0-17.5以g/mL將溶液做成3個平行樣，連續三天獲取HPLC和UV的數據。通過回歸分析評估線性，用最小二乘法計算，并用方差分析（ANOVA）評估擬合度。準確度和精密性在容器中通過往空白對照品溶液中加入已知數量的阿托伐他汀鈣標準物質（分別加入對應正常值的25%、100%和125%的阿托伐他汀鈣），進行回收試驗，來考察分析方法的準確度。具體方法為，將含有20mg/mL的，體積為1.0,4.0和5.0mL的阿托伐他汀鈣標準物質用甲醇溶解，分別加入到含有溶生介質和空白對照品的容器中，最終體積為900mL。預熱至37±0.5°許使用USP方法2,50rpm轉速旋轉60min。等份取樣，過濾，必要時可以用溶劑稀釋，并通過HPLC和UV進行分析。上述研究在3個不同的日子進行，分別檢測所添加物質的回收率。為了評估該方法的重復性，精密度實驗與準確度考察同時開展。2名不同的分析人員在不同日期對RP片的溶由曲線進行中間精密度分析，同時每次分析都當天配制標準物質溶液。基于相對標準誤差（RSD）確定重復性，基于每個時間點兩個溶液間的差異確定中間精密度。溶液脫氣和過濾器的影響將溶液加熱到42。C脫氣，然后真空過濾。比較用脫氣溶液和非脫氣溶液獲得的溶由曲線，確定實驗中應使用脫氣后的溶液。將與正常片重量一致的空白對照品轉移至燒杯中，37±0.5。攬拌1小時，隨后加入阿托伐他汀鈣，終濃度為250以g/mL。抽取10mL等份試樣,35以m過濾器過濾后用流動相稀釋，得到濃度為100以g/mL的溶液，上樣前再用0.45以m的膜過濾。相同溶液的另一份試樣按相同的程序操作，但以3000rpm離心5分鐘，不過濾。色譜分析結果顯示，可以使用過濾器過濾。過濾后樣品的檢測結果在未過濾的標準物質溶液、離心后的樣品溶液的98-102%之間。耐用性通過在一定程度上改變溶液的pH值（pH5.8和6.2）的方法測試溶生度方法的耐用性。藥物在調整過pH的緩沖液中的溶生度和正常條件下（pH6.0）的溶由度相比，通過Student'檢驗分析。HPLC和UV間的比較，不同溶由曲線間的比較通過Student'檢驗，評估HPLC和UV兩種方法檢測阿托伐他汀鈣溶生度實驗中的適用性。比較中使用的數值是通過在5,10,15,30,45,和60分鐘在每個單獨的容器中取樣得到的中間精密度。RP、PA和PB的溶由曲線通過非模型依賴型的方法分析，包括差異因子f1和相似因子f2o結果和討論阿托伐他汀鈣溶解度和漏槽條件阿托伐他汀鈣溶解度的結果（圖1）是溶由介質和漏槽條件選擇的基礎。pH6.0和6.8的磷酸鉀緩沖液滿足80mg劑量的漏槽條件，因此在初步研究中使用這兩種緩沖液。圖1:阿托伐他汀鈣在不同介質中的溶解度（37攝氏度、24小時）溶由方法選擇首先，在37±0.5°條件下，按美國藥典方法1,以75和100的轉速分別在900ml的pH6.0和pH6.8的磷酸鉀緩沖液中檢測參比制劑的溶生度（n=6）o按照美國藥典方法1,使用40目的籃子不能使足夠的藥物從籃中轉移到溶液中，又因為片重較重（約1000mg）,轉速也不合適。在增加轉速至100rmp后，阿托伐他汀鈣的溶解度最大只達到80%o上述實驗結果不值得繼續開發籃法的溶生方法，為了獲得阿托伐他汀鈣的完全溶生，我們對美國藥典方法2進行了研究。采用美國藥典方法2,在pH6.0的900mL溶液中用50和75rpm的速度攪拌。溶由曲線顯示此法可以獲得較高的溶生速率，在75rpm的轉速下達到快速溶生，特別是當與50的轉速相比，前3個取樣點的溶生最為明顯。即使采用較低的轉速，開始階段的溶生較慢，且更平緩，但與體內吸收數據相比，仍然超生了希望的IVIVC水平（圖2）。圖2:槳法，轉速50和75rmp,pH6.0的900mL磷酸緩沖液條件下，阿托伐他汀鈣參比制劑（n=6）的溶由曲線為了降低溶由速率，我們嘗試了降低攪拌槳的轉速至35和40rpm。結果顯示與先前的實驗相比，降低轉速的確可以減緩溶生速率，開始階段溶生也較平穩，但這樣會使溶生過程暫停，部分劑量始終不能溶解。為了使藥物完全溶解，同時獲得IVIVC,我們選擇了美國藥典方法2,50rpm轉速，pH6.0和6.8的900mL緩沖液。這些條件用來與體內吸收數據相比，建立最有區分力的溶生方法。盡管溶由速率高于體內吸收，但這兩種條件下RP和PB都可以完全的溶由。由于處方中竣甲基纖維素含量較低,PA在上述條件下未能完全溶由（圖3）o圖3:槳法，50rpm轉速，pH6.0(a)和pH6.8(b)的磷酸鹽緩沖液中，各樣品的溶由曲線，用以篩選最有區分力的溶生條件。溶生方法的靈敏度是指該方法能反映由產品變化的能力。一個有區分力的溶生方法，應該在模擬胃腸道(TGI)的體外測試環境下，反映由藥品在體內吸收的過程。在圖3中可以看由，pH6.0的磷酸鉀緩沖液(f2=63.74)與pH6.8的磷酸鉀緩沖液(PB和RP的f2=81,19)相比，前者更好的對應藥物的體內數據。盡管溶生和吸收的速率不同，兩種制劑的輕微的體內吸收差異也可以通過溶由差異反映由來。pH6.0的緩沖液可以使RP和PB都獲得與吸收曲線有較好對應的溶由曲線。在這種介質中，采用槳法、50rpm轉速，可以觀察到產品見有不同的溶由曲線，和體內吸收曲線觀察到的差異一致。當使用pH6.8的緩沖液時沒有觀察到這種現象。因此，我們提由為了獲得最有區分力的溶由曲線，槳法，50rpm轉速，pH6.0的磷酸鹽緩沖液是最合適的。需要補充說明的是，在初步研究階段，與剛剛配置的樣品相比，阿托伐他汀鈣樣品在實驗條件下的穩定性范圍是99.59%-101.06%,說明樣品在配置后24小時中可以保持100±2%勺穩定性范圍。IVIVC過程中體內數據的處理阿托伐他汀鈣的體內數據通過RP和PB的體內生物等效性試驗獲得。體內試驗采用的樣品批次與溶生方法開發和IVIVC中用到的批次一致。阿托伐他汀鈣在二室模型中的平均血藥濃度如圖4所示。選擇這個模型是基于最佳數學和圖形擬合。通過Scientist?程序計算從生物等效性試驗中獲取的平均血藥濃度，與程序預測值進行疊加計算，并運用模型選擇標準進行判斷。血藥濃度-時間數據通過Loo-Riegelman法轉化為吸收分數（FA）。圖3a顯示了服用RP和PB的阿托伐他汀鈣后吸收分數-時間曲線。通過與生物等效性試驗獲得的FA相比，RP和PB都有更快的溶由曲線。由于數據問的內在差異，無法得到合適的線性關系。圖4:阿托伐他汀鈣參比制劑（a）和中試批（b）的平均藥時濃度曲線。因此，我們采用了時間比例因子的方法。這個因子可以用于體外溶由速率快于或慢于體內吸收速率的情況下。時間比例因子可以通過將一定劑量的藥物在體內吸收所需的時間，與相同劑量的藥物在體外溶生所需要的時間進行對比。在對原點（零）進行線性回歸后，將直線的斜率作為時間比例因子，從而獲得IVIVCo因此，我們在10-90%的劑量分數內，對比了體內吸收和體外溶生的時間，結果如表II所示。圖5展示了數據之間的關系，RP和PB的斜率分別為5.7和6.1o表II:PR和PB在一定劑量分數下的溶由時間（TD）和吸收時間（TA）圖5:溶生或吸收相同質量的阿托伐他汀鈣，內體所需時間和體外時間的線性回歸關系因此，通過此方法可以得到時間比例因子大約為6.0o之后將這個值用于RP和PB的體內吸收曲線、體外溶由曲線的比較（圖6）。給定時間內的溶由分數，與時間乘以6的吸收分數做對比。表III顯示了線性回歸的結果，在900毫升pH6.0的磷酸鉀緩沖液，槳法50rpm的條件下，可以建立A級水平的相關性。圖6:引入時間比例因子后，參比制劑（a）和中試批產品（b）的溶由-吸收關系表III:采用時間比例因子后的IVIVC回歸分析使用相關方程，評估使用RP和PB預測的FA及預測誤差，以評估模型的準確度。每個誤差反映了預測值和實測值的差異，這個差異低于FDA1997年設定的10%的標準以下。這表明我們提由的溶生度方法有很高的精確度，可以作為體內研究的替代方法（表IV）。溶生度方法驗證專屬性色譜分析顯示在相同的保留時間內，空白對照制劑沒有顯示吸收峰。PDA檢測器顯示，峰純度高于0.9999o止匕外，專屬性分析表明UV法在245nm處沒有收到輔料的干擾，因此在此溶生方法中，HPLC和UV法都可以用于阿托伐他汀鈣的定量檢測。線性HPLC（濃度范圍10.0至175.0以g/mL）和UV（濃度范圍1.0-17.5以g/mL）的方法都進行了線性研究，兩者的確定系數分別為0.9995和0.9999。在pH6.0的磷酸緩沖液中，線性回歸得到的方程分別為：HPLC:y=46546x?8588.7,UV:y=0.0374x0.083。ANOVA分析顯示，線性無顯著性差異（p>0.05）。用student'St驗評估截距在回歸方程中的意義，結果表明與理論0值無差異，兩種方法的p>0.05o準確度、精密度通過加入已知質量的阿托伐他汀鈣，測量回收率的方法評估準確度。連續三天，每個阿托伐他汀鈣濃度分別用HPLC和UV進行兩次測量。HPLC測得的平均回收率為（平均數%iRSD99.60±1.55,99.81±1.2和99.56±0.93,使用UV法測得的平均回收率為99.40±1.82,101.42±0.94101.82±1.26o較低的RSD水平表明，本文表述的溶由曲線的定量分析有較好的準確度和精密度。中間精密度通過比較參比制劑的兩條溶由曲線考察。HPLC和UV法在每個時間點上的檢測結果與平均數（n=6）的差異都小于2%,確定了方法的精密度。評估脫氣與過濾器的使用溶解在溶劑中的氣體可能通過多種方式影響試驗結果。溶解性氣體可以顯著改變非緩沖液的pH值，通過形成氣泡改變流體流動模式，并改變活性成分的性質和分析結果。在非脫氣和脫氣的溶劑中進行的實驗顯示樣品溶由行為不受影響，在溶生度測試中也沒有觀察到干擾。過濾器的評估，對于確定它是否可以