考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白質含量：分光光度的使用【實驗目的】

1.掌握考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質的原理與方法。

2.熟練分光光度計的使用和操作方法。

【實驗原理】

考馬斯亮藍G250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在465nm；當它與蛋白質通過范德華鍵結合成復合物時變為藍色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數更大。

在一定蛋白質濃度范圍內(1～1000μg/ml）,蛋白質－染料復合物在595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G250的結合十分迅速，約2min即可反應完全，其復合物在1h內保持穩定。由于蛋白質－染料復合物具有很高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度（最低檢出量為1μg）。由于染色法簡單迅速，抗干擾性強，靈敏度高，線性關系好，近年來在某些方面有取代經典的Lowry法的趨勢，是一種較好的蛋白質快速微量測定方法。【器材與試劑】（一）器材

1.可見光分光光度計

2.刻度移液管

3.移液槍

4.新鮮小麥葉片或綠豆芽下胚軸等（二）試劑

1.0.9%生理鹽水

2.考馬斯亮藍試劑

3.1000μg/ml蛋白質標準液分光光度計的分類

紅外分光光度計:可見光分光光度計:紫外分光光度計:測定波長范圍為大于760nm的紅外光區

測定波長范圍為400~760nm的可見光區測定波長范圍為200～400nm的紫外光區可見光譜可見光范圍內波長和顏色的關系分光光度計的基本結構

無論哪一類分光光度計都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示:

入射光強度Io透射光強度I樣品池

檢測器及儀表單色器光源光照射到物質上，物質的分子結構決定哪些特定波長的光被吸收。這一現象符合符合朗伯－比耳定律。入射光強度Io樣品濃度c光程b透射光強度I當一束平行單色光(I0)照射有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液(I)朗伯—比爾定律:

A=lg(1/T)=Kbc

A為吸光度;T為透光度,是透射光強度比上入射光強度（I/I0);c為吸光物質的濃度;b為吸收層厚度(光程）.

物理意義當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質時,其吸光度A與吸光物質的濃度c及吸收層厚度b成正比.

測量條件選擇（1）儀器預熱是保證儀器準確穩定的重要步驟。（2）比色皿的清潔程度，直接影響實驗結果。比色皿與分光光度計應配套使用。

比色皿內盛液應為其容量的2/3。（3）選擇適宜波長的入射光：由于物質對光有選擇性吸收，為了使測定結果有較高的靈敏度，必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。（4）控制吸光度A的準確的讀數范圍：吸光度控制在0.1~0.8讀數范圍內時，測量的準確度較高。（5）選擇參比溶液：參比溶液是用來調節儀器工作零點的。無色樣品可用蒸餾水作參比溶液；反之應采用不加樣品（加顯色劑）的溶劑作參比溶液。722型光柵分光光度計使用方法100調波長旋鈕電源開關T/A切換旋鈕消光零0靈敏度暗盒蓋比色皿拉桿顯示窗口1．調整（1）接通電源。（2）調波長調節器至所需波長。（3）開啟電源開關，指示燈亮，選擇開關置于“T”，將靈敏度旋鈕調至”1”檔位，調節透光率[100%T]。預熱20min.預熱儀器應在不測定時，將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。2．校正（1）打開吸收池暗室蓋，調節[0%T]旋鈕，使數字顯示為“00.0”，將參比溶液置于光路，蓋上吸收池蓋，調節透光率[100%T]旋鈕，數字顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當增加電流放大器靈敏度檔數，當改變靈敏度后必須重新校正“0”和“100”。（3）按（1）連續幾次調整“00.0”和“100.0”后，將選擇開關置于“A”，調節吸光度調零旋鈕，使數字顯示為“.000”，即可進行吸光度A的測量.3．測定將待測樣品的比色皿放入相應的樣品穴，輕輕拉動比色皿座架拉桿，使待測溶液進入光路，測定。顯示值（小數后三位數）即為待測樣品的吸光度值Ａ。讀數后，打開比色皿暗箱蓋。4.關機實驗完畢，切斷電源，將各調節旋鈕恢復至初始位置。將比色皿取出洗凈，晾干，存于專用盒內，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈?！咀⒁馐马棥?/p>

1）為了防止光電管疲勞不測定時須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。

2）比色皿的使用方法：①拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面。②每次做完實驗時，應立即洗凈比色皿。清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。必要時可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1∶2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，。不能用毛刷清洗。③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。

3）在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差?！緦嶒灢襟E】（一）、標準曲線的制作1.取試管6支，按下表進行編號并加入試劑。試劑試管編號1234561000μg/ml標準蛋白溶液（μl）0204060801000.9%生理鹽水（μl）100806040200蛋白質含量（μg/0.1ml）0204060801002.分別向上述各管加入3.0ml考馬斯亮藍G250試劑,充分振蕩混合，放置5min后，測定A595值。3.以A595為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。（二）樣品提取液中蛋白質含量的測定蛋白質提取:

稱取樣品約200mg，加蒸餾水5ml，勻漿，4000rpm離心10min，取上清液。殘渣用2.0ml蒸餾水懸浮，4000rpm離心10min，合并上清液并定容至10ml。2.蛋白質含量測定:

取3支試管，各吸取樣品提取液0.1ml，加入考馬斯亮藍G250試劑3.0ml，充分振蕩混合,放置5min后，測A595值。3.根據A595值，在標準曲線上求出樣品中蛋白含量。

樣品蛋白質含量（μg/g鮮重）=m(μg)×提取