RNA干擾抑制CD147表達對人胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響2022.5.18王書奎MD,PhD南京醫科大學附屬南京第一醫院第一頁，共四十九頁。報告內容研究背景研究目標實驗方法與結果實驗結論第二頁，共四十九頁。一、研究背景第三頁，共四十九頁。胃癌概況

胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位。其惡性程度較高，轉移擴散嚴重，多數患者就診時已屬中晚期，因而死亡率較高。第四頁，共四十九頁。MMP簡介腫瘤的侵襲和轉移是一個復雜的過程，其中細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤轉移過程中的重要步驟。這與細胞外基質金屬蛋白酶〔extracellularmatrixmetalloproteinase，MMP〕的參與密不可分。第五頁，共四十九頁。

MMP是一個鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已發現26種。MMP的主要功能是降解細胞外基質。腫瘤細胞利用MMP的基質降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質交界處，MMP往往高表達。第六頁，共四十九頁。 20世紀80年代，Biswas實驗室從人肺癌細胞株LX-1的細胞膜上別離得到了一種58kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子〔tumorcollagenasestimulatingfactor，TCSF〕。第七頁，共四十九頁。進一步研究說明TCSF不僅能刺激MMP-1的產生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產生，因此將其重命名為細胞外基質金屬酶誘導因子〔extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，EMMPRIN)。第六屆人類白細胞分化抗原協作組會議將EMMPRIN命名為CD147。第八頁，共四十九頁。CD147的結構

CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個半胱氨酸殘基形成2個二硫鍵，構成2個典型的半球形Ig結構域。

第九頁，共四十九頁。細胞內的CD147存在低糖基化〔lowglycosylatedCD147，LG〕和高糖基化〔highglycosylatedCD147，HG〕形式，分子量分別是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的產生。第十頁，共四十九頁。CD147的功能CD147是一種廣泛表達于細胞外表，在體內分布廣泛，參與精子發生、胚胎發育、腫瘤的侵襲和轉移、炎癥反響、病毒感染等多種生理和病理過程，是一個多功能的分子。第十一頁，共四十九頁。

免疫組化實驗證實CD147在多種惡性腫瘤中高表達，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達水平也越高。第十二頁，共四十九頁。CD147在腫瘤發生開展中的作用

1.促進腫瘤的侵襲和轉移

CD147就是通過刺激成纖維細胞及腫瘤細胞本身產生多種MMP來降解基底膜和細胞外基質，從而促進腫瘤的浸潤和轉移的。第十三頁，共四十九頁。2.誘導腫瘤血管生成血管內皮生長因子〔vascularendothelialgrowth

factor，VEGF〕是很多情況下血管生成過程的主要調節因子，包括腫瘤形成過程。CD147可以誘導VEGF的表達。第十四頁，共四十九頁。

3.促進腫瘤細胞多藥耐藥

在多種多藥耐藥的腫瘤細胞中都觀察到CD147的高表達。CD147可激活PI3K/AKT細胞存活信號通路。在大多數惡性腫瘤細胞中此通路均被激活。第十五頁，共四十九頁。胃癌中CD147的表達日本Toyama大學的ZhengHC等研究說明：在正常胃黏膜開展為增生性或化生性胃黏膜，最后開展為胃癌的過程中，CD147的表達量是逐漸增加的，并且CD147的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達呈正相關。第十六頁，共四十九頁。胃癌組織中CD147的表達CD147在胃癌組織中高表達第十七頁，共四十九頁。二.研究目標第十八頁，共四十九頁。

本實驗旨在運用RNA干擾技術抑制胃癌細胞株SGC7901中CD147基因的表達，研究該基因沉默后對腫瘤細胞生長、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。第十九頁，共四十九頁。三、研究方法及結果第二十頁，共四十九頁。CD147shRNA真核表達載體的構建與鑒定↓轉染SGC7901細胞，篩選穩定表達干擾載體的SGC7901細胞株↓MTT法檢測SGC7901細胞增殖水平的變化↓明膠酶譜法檢測SGC7901細胞MMP-2、MMP-9分泌的變化↓SGC7901細胞體外侵襲力測定↓MTT檢測SGC7901細胞順鉑敏感性的變化技術路線技術路線第二十一頁，共四十九頁。胃癌細胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結轉移瘤。研究說明其侵襲能力強，惡性程度高。我們前期研究說明，該細胞外表CD147是高表達的。第二十二頁，共四十九頁。shRNA〔shorthairpinRNA〕表達載體的構建pSilencer3.1-H1neo第二十三頁，共四十九頁。shRNA模板的設計示意圖第二十四頁，共四十九頁。干擾靶序列的選擇

參考陳翔等的報道，選取CD147mRNA370-390和808-828作為靶序列，相應的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另外，設計一個陰性對照shRNA-control。第二十五頁，共四十九頁。RNAi靶序列在CD147mRNA上的位置

1AGCGGTTGGAGGTTGTAGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATGGCGGCTGC51GCTGTTCGTGCTGCTGGGATTCGCGCTGCTGGGCACCCACGGAGCCTCCG101GGGCTGCCGGCACAGTCTTCACTACCGTAGAAGACCTTGGCTCCAAGATA151CTCCTCACCTGCTCCTTGAATGACAGCGCCACAGAGGTCACAGGGCACCG201CTGGCTGAAGGGGGGCGTGGTGCTGAAGGAGGACGCGCTGCCCGGCCAGA251AAACGGAGTTCAAGGTGGACTCCGACGACCAGTGGGGAGAGTACTCCTGC301GTCTTCCTCCCCGAGCCCATGGGCACGGCCAACATCCAGCTCCACGGGCC351TCCCAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCGTCAGAACACATCAACGAGGGGGAGA401CGGCCATGCTGGTCTGCAAGTCAGAGTCCGTGCCACCTGTCACTGACTGG451GCCTGGTACAAGATCACTGACTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAACGGCTC501CGAGAGCAGGTTCTTCGTGAGTTCCTCGCAGGGCCGGTCAGAGCTACACA551TTGAGAACCTGAACATGGAGGCCGACCCCGGCCAGTACCGGTGCAACGGC601ACCAGCTCCAAGGGCTCCGACCAGGCCATCATCACGCTCCGCGTGCGCAG651CCACCTGGCCGCCCTCTGGCCCCTCCTGGGCATCGTGGCTGAGGTGCTGG701TGCTGGTCACCATCATCTTCATCTACGAGAAGCGCCGGAAGCCCGAGGAC751GTCCTGGATGATGACGACGCCGGCTCTGCACCCCTGAAGAGCAGCGGGCA801GCACCAGAATGACAAAGGCAAGAACGTCCGCCAGAGGAACTCTTCCTGAG851GCAGGTGGCCCGAGGACGCTCCCTGCTCCACGTCTGCGCCGCCGCCGGAG901TCCACTCCCAGTGCTTGCAAGATTCCAAGTTCTCACCTCTTAAAGAAAAC951CCACCCCGTAGATTCCCATCAT第二十六頁，共四十九頁。設計好的shRNA插入序列shRNA15'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3'shRNA2

5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’shRNA-control5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3'5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’第二十七頁，共四十九頁。2、CD147shRNA表達載體的構建：

將合成的三對片段分別用水浴中加熱后退火備用，與經BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer3.1-neo質粒連接，構建成CD147shRNA表達載體，重組質粒分別命名為pSilencer-shRNA1，pSilencer-shRNA2和pSilencer-shRNA-control。第二十八頁，共四十九頁。重組質粒測序鑒定結果DNA測序說明，3個重組質粒構建正確。pSilencer/shRNA1測序圖（紅線為插入片段）第二十九頁，共四十九頁。轉染及篩選

脂質體轉染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培養基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽性細胞克隆用有限稀釋法別離出來并逐步擴增以待進一步分析。篩選出的細胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。第三十頁，共四十九頁。Real-timePCR檢測CD147mRNA表達水平

與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細胞中CD147mRNA相對表達量分別下降至72.4%和17.3%

。第三十一頁，共四十九頁。1234HGLGCD147β-actinLane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-controlLane3:SGC7901/shRNA1Lane4:SGC7901/shRNA2HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Westernblot結果與Real-timePCR結果相符。第三十二頁，共四十九頁。接種細胞

培養細胞

加入MTT呈色

終止培養

比色

結果計算

抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)／對照組A值×100%

24h、48h、72h時間點MTT細胞增殖實驗第三十三頁，共四十九頁。

與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細胞增殖能力均顯著降低.而陰性對照組SGC7901/shRNA-control增殖能力無顯著改變。第三十四頁，共四十九頁。明膠酶譜法檢測細胞上清中MMP-2和MMP-9的活性明膠酶包括72kDa的明膠酶A〔基質金屬蛋白酶-2，MMP-2〕和92kDa的明膠酶B(基質金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物為基底膜中的Ⅳ型膠原和變性的間質膠原〔明膠〕，其活性與腫瘤細胞侵襲和轉移能力密切相關。第三十五頁，共四十九頁。

明膠酶譜法是一種測定明膠酶活性的常用方法。收集細胞培養上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開，顯示兩條負染條帶，根據條帶的面積和亮度可判定明膠酶的活性。第三十六頁，共四十九頁。明膠酶譜結果MMP-2MMP-9

123Lane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-control.Lane3:SGC7901/shRNA2**BSGC7901/shRNA2細胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明顯降低第三十七頁，共四十九頁。Transwell原理

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結構。第三十八頁，共四十九頁。Transwell結果穿過Transfer侵襲小室的染成紫色的細胞〔×400〕SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2第三十九頁，共四十九頁。SGC7901/shRNA2細胞體外侵襲能力顯著降低B*第四十頁，共四十九頁。順鉑敏感性實驗抗腫瘤藥物順鉑的使用濃度以血漿峰濃度〔PeakPlasmaConcentration，PPC)為標準。參照Sondak等的報道，順鉑的PPC為3.0μg/ml。本實驗中使用的順鉑濃度為：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。細胞生長抑制率〔%〕=[1-OD(cisplatin＋〕/OD(cisplatin－)]×100%第四十一頁，共四十九頁。

與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，順鉑對SGC7901/shRNA2的抑制率顯著增加***第四十二頁，共四十九頁。四、實驗結論第四十三頁，共四十九頁。成功構建了靶向CD147的shRNA真核表達載體；成功轉染了人胃癌細胞SGC7901，并獲得了穩轉細胞株，經Real-timePCR、WesternBlot檢測，CD147在mRNA和蛋白水平均被顯著抑制；CD147表達沉默后SGC7901的增殖能力明顯降低，細胞的MMP-2和MMP-9的活性明顯降低，細胞的體外侵襲能力明顯降低，細胞對化療藥物順鉑的敏感性增強。第四十四頁，共四十九頁。我們的研究說明：CD147在胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和化療藥物敏感性中發揮重要作用；CD147可能是胃癌治療的一個有效的靶點。第四十五頁，共四十九頁。下一步的研究方向1.動物水平的實驗〔裸鼠移植瘤模型，體內腫瘤細胞侵襲實驗〕；2.CD147自身的表達調控；3.CD147在其他消化系統腫瘤中的作用；4.CD147多藥耐藥的機制。第四十六頁，共四十九頁。第四十七頁，共四十九頁。Thanksforyourattention!第四十八頁，共四十九頁。內容總結RNA干擾抑制CD147表達對人胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響。胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位。轉染SGC7901細胞，篩選穩定表達干擾載體的SGC7901細胞株。脂質體轉染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培養基篩選2周，然后改為半量維持。細胞生長抑制率〔%〕=[1-OD(cisplatin＋〕/OD(cisplatin－)]×100%第四十九頁，共四十九頁。冬季瘙癢癥大頭醫生編輯整理英文名稱pruritushiemalis

別名asteatoticeczema；eczemacraquele；prurigohiemalis；冬令瘙癢；冬令瘙癢癥；冬令濕疹；干性濕疹；干燥性瘙癢；裂隙性濕疹；皮脂缺乏性濕疹類別皮膚科/神經功能障礙性皮膚病/癢疹ICD號I28.2概述冬季瘙癢癥又稱皮脂缺乏性濕疹(asteatoticeczema)，裂隙性濕疹(eczemacraquele)，冬令濕疹。主要見于老年人皮膚，特別是小腿、前臂和手部發生以干燥和發裂為突出的濕疹樣皮炎。流行病學本病好發于夏季，有過敏體質的人多發，嬰幼兒的發病率高于成年人。病因皮膚中皮脂缺乏及水分丟失可能是主要的原因。而造成皮脂缺乏的因素很多，有皮膚自然干燥伴明顯皮脂缺乏、年齡(老年者)、疾病、營養不良、皮膚萎縮、硬化、缺汗、內分泌功能減退、環境濕度、角層貯藏水分的完整性破壞等。發病機制某些疾病如癌癥、肝膽疾病、HIV感染、營養不良、藥物或接觸某些化學物質導致表皮水分減少、皮膚干燥等均可發生皮膚瘙癢，經常搔抓進而出現炎癥而發病。臨床表現皮膚干燥，或有少許柔軟細薄鱗屑，皮膚皺紋清楚，因血流緩慢，局部溫度比正常低。掌部皮膚較粗糙，特別在指墊處，紋路寬深，重者出現裂隙。因反復搔抓后可發生炎性程度不同的濕疹，以丘斑疹為主，水皰、糜爛或滲出較少。反復發生，病程慢性，可經久不愈?；颊咂つw可見開裂，開裂可以分為3個階段，稱為皴裂、?裂和皸裂，皴裂可見于冬季老年人的腿部，特別是小腿伸側，天然帶方形鱗屑，像魚鱗一樣，邊緣可略為翹起，中心黏著，剝之易脫落，但又重新長出；可無主觀感覺，或稍有不同程度的癢感。臨床表現老年人鱗屑較多，抓之層層脫落。如