基因治療腫瘤策略及進(jìn)展6、露凝無游氛，天高風(fēng)景澈。7、翩翩新來燕，雙雙入我廬，先巢故尚在，相將還舊居。8、吁嗟身后名，于我若浮煙。9、陶淵明（約365年—427年），字元亮，（又一說名潛，字淵明）號(hào)五柳先生，私謚“靖節(jié)”，東晉末期南朝宋初期詩(shī)人、文學(xué)家、辭賦家、散文家。漢族，東晉潯陽(yáng)柴桑人（今江西九江）。曾做過幾年小官，后辭官回家，從此隱居，田園生活是陶淵明詩(shī)的主要題材，相關(guān)作品有《飲酒》、《歸園田居》、《桃花源記》、《五柳先生傳》、《歸去來兮辭》等。10、倚南窗以寄傲，審容膝之易安。基因治療腫瘤策略及進(jìn)展基因治療腫瘤策略及進(jìn)展6、露凝無游氛，天高風(fēng)景澈。7、翩翩新來燕，雙雙入我廬，先巢故尚在，相將還舊居。8、吁嗟身后名，于我若浮煙。9、陶淵明（約365年—427年），字元亮，（又一說名潛，字淵明）號(hào)五柳先生，私謚“靖節(jié)”，東晉末期南朝宋初期詩(shī)人、文學(xué)家、辭賦家、散文家。漢族，東晉潯陽(yáng)柴桑人（今江西九江）。曾做過幾年小官，后辭官回家，從此隱居，田園生活是陶淵明詩(shī)的主要題材，相關(guān)作品有《飲酒》、《歸園田居》、《桃花源記》、《五柳先生傳》、《歸去來兮辭》等。10、倚南窗以寄傲，審容膝之易安。基因治療腫瘤的策略2文檔之家-shop63695479.taobao/腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療最引人矚目的研究領(lǐng)域，是繼手術(shù)、放療、化療、免疫治療之后的第五種模式,是腫瘤治療的有益補(bǔ)充。基因治療就是用正?；蛞吧突蛐Ｕ蛑脫Q致病基因的一種治療方法。3文檔之家-shop63695479.taobao/本文選取筆者所在學(xué)校的七年級(jí)、八年級(jí)和九年級(jí)學(xué)生作為調(diào)查研究對(duì)象，采用個(gè)別交談、走訪家長(zhǎng)、問卷調(diào)查等方法，結(jié)合教育學(xué)、教育心理學(xué)的相關(guān)知識(shí)對(duì)農(nóng)村初中學(xué)生存在的不良行為習(xí)慣進(jìn)行了比較科學(xué)的分析。一、不良行為習(xí)慣的學(xué)生具體表現(xiàn)筆者通過隨機(jī)抽樣調(diào)查，對(duì)我校七年級(jí)、八年級(jí)和九年級(jí)學(xué)生進(jìn)行了問卷調(diào)查。樣本為每個(gè)年級(jí)100名。通過調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我得出以下結(jié)果。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了比較細(xì)致的分析。（見附表1）（一）怠惰行為方面從調(diào)查結(jié)果中可以看出，學(xué)生的懈怠行為排在五項(xiàng)調(diào)查結(jié)果的第二位，說明學(xué)生的懈怠行為比較嚴(yán)重，也說明其學(xué)習(xí)的主動(dòng)性沒有養(yǎng)成。（二）攻擊性行為方面具體表現(xiàn)為容易和學(xué)生發(fā)生沖突，打架、說臟話、蠻橫不講理、喜歡在課堂上搞小動(dòng)作引起其他學(xué)生注意，不僅自己不學(xué)習(xí)，而且還影響課堂教學(xué)的正常進(jìn)行。通過調(diào)查訪問，我們了解到不少學(xué)生具有暴力傾向，這種傾向形式多樣。這些都表明農(nóng)村初中學(xué)生受環(huán)境和年齡特征的影響，自控力較差，在其他人面前喜歡表現(xiàn)自己，引起他人注意，卻無法認(rèn)識(shí)到這些行為的正確性，且不顧及其他人的感受。（三）欺騙性行為方面從附表1我們可以得出，有相當(dāng)一部分學(xué)生有過欺騙行為，缺乏誠(chéng)實(shí)。這點(diǎn)尤其體現(xiàn)在與他們自己身份相關(guān)的作業(yè)抄襲方面。這說明這些學(xué)生比較懶惰，不喜歡思考問題，總想著不勞而獲。（四）逆反性行為方面調(diào)查結(jié)果表明，部分學(xué)生存在非常嚴(yán)重的逆反心理，具體表現(xiàn)為容易和老師、家長(zhǎng)和他人發(fā)生沖突，反映了這個(gè)年齡段的孩子已經(jīng)出現(xiàn)了強(qiáng)烈的自我中心意識(shí)，喜歡我行我素，藐視“權(quán)威”，敢于向“權(quán)威”挑戰(zhàn)。（五）破壞性行為方面從附表1可以看出，此階段的學(xué)生有著比較嚴(yán)重的破壞性行為，具體表現(xiàn)在不愛護(hù)公共物品，喜歡到處亂寫亂畫。這些說明孩子們沒有受到過相關(guān)的思想教育，缺乏愛護(hù)公共物品的意識(shí)。二、學(xué)生不良行為習(xí)慣的形成原因通過對(duì)調(diào)查問卷調(diào)查分析，加上對(duì)具有不良行為的學(xué)生的家訪和同其科任老師的座談，我們發(fā)現(xiàn)：學(xué)生不良行為產(chǎn)生的原因不簡(jiǎn)單是思想問題，很大程度上與其復(fù)雜的社會(huì)因素和歷史因素有關(guān)。我們將其分為主觀因素和客觀因素兩個(gè)方面。（一）主觀因素1.該年齡段的孩子自我意識(shí)開始萌發(fā)，表現(xiàn)在自尊心和成人感的出現(xiàn)和增強(qiáng)。但是這些在沒有科學(xué)的指引下，往往形成了不正確的價(jià)值觀，這種價(jià)值觀導(dǎo)致他們往往出現(xiàn)上述問題，如對(duì)父母、老師和社會(huì)強(qiáng)烈不滿，這些不滿在沒有得到很好的解決后，往往演變成孩子們的逆反情緒。2.該年齡段的孩子自我意識(shí)的出現(xiàn)，往往沒有形成公正、客觀和正直的性格特征，形成的卻是偏激、扭曲的個(gè)性。這些和他們的知識(shí)儲(chǔ)備以及年齡階段所導(dǎo)致的思考能力不完善有關(guān)，所以容易出現(xiàn)以自我為中心的，對(duì)人和事出現(xiàn)比較偏激和不成熟的評(píng)價(jià)。比如在遇到好友被人欺負(fù)時(shí)，他們會(huì)“義薄云天”地挺身而出，卻不會(huì)思考事情的來龍去脈，不會(huì)思考自己的行為是對(duì)是錯(cuò)，更不會(huì)思考如何采用更加合理和理性的方法來解決此類問題。3.該階段的學(xué)生在性意識(shí)上有所覺醒，這也會(huì)導(dǎo)致他們行為的超常性。隨著生理特征的變化，性心理開始躁動(dòng)，開始喜歡在異性面前表現(xiàn)自己，引起異性的注意。但是，該階段孩子引起異性的行為卻往往表現(xiàn)得讓家長(zhǎng)和老師比較難理解。（二）客觀因素客觀因素可以從家庭、學(xué)校和社會(huì)等三個(gè)方面進(jìn)行分析。1.家庭因素家庭的氣氛和教育環(huán)境對(duì)于該階段學(xué)生行為習(xí)慣的養(yǎng)成最為直接和主要。由于我校處在貧困地區(qū)的農(nóng)村地區(qū)，其經(jīng)濟(jì)相對(duì)安定區(qū)其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)來說比較落后，人口素質(zhì)也相對(duì)較低，表現(xiàn)在家庭教育上相對(duì)滯后。不必掩飾地說，農(nóng)村家庭環(huán)境是上述行為出現(xiàn)的重要發(fā)源地之一。2.學(xué)校因素學(xué)校方面也存在諸如教育評(píng)價(jià)機(jī)制不完善和部分教師教育行為不當(dāng)?shù)膯栴}。（1）教育評(píng)價(jià)體制的不完善?，F(xiàn)今的教育評(píng)價(jià)機(jī)制主要依據(jù)的是學(xué)生參加各類考試的成績(jī)和獲獎(jiǎng)情況，而社會(huì)和家長(zhǎng)也只關(guān)注學(xué)校的升學(xué)情況，這些評(píng)價(jià)機(jī)制直接產(chǎn)生的問題便是教師大多重視對(duì)學(xué)生考試能力的培養(yǎng)和知識(shí)的灌輸，較少涉及對(duì)學(xué)生思想品德的關(guān)注。也許可以花費(fèi)精力去為學(xué)生進(jìn)行課業(yè)輔導(dǎo)，但是一般沒有老師會(huì)占用自己的時(shí)間去對(duì)學(xué)生進(jìn)行心理輔導(dǎo)和教育。（2）教師的教育行為不當(dāng)。部分教師的教育觀念陳舊，教學(xué)手段落后。這點(diǎn)在學(xué)生德育上體現(xiàn)得尤為突出。對(duì)學(xué)生的教育停留在羞辱和體罰上。殊不知這些行為很容易讓學(xué)生產(chǎn)生很多問題，如緊張、厭學(xué)、厭師以及對(duì)考試和學(xué)業(yè)的壓力。該階段是學(xué)生升入高中的重要階段，因此學(xué)生的學(xué)習(xí)壓力大，學(xué)業(yè)任務(wù)重，考試頻率高，這些都容易讓原本學(xué)習(xí)就薄弱的學(xué)生更容易自暴自棄，產(chǎn)生厭學(xué)情緒和考試焦慮癥。所有的這些都會(huì)對(duì)學(xué)生的行為方式產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。曾經(jīng)聽一個(gè)畢業(yè)好多年的學(xué)生說過這樣一個(gè)事例，他好多次在夢(mèng)中仍然夢(mèng)見自己在參加考試，而且每次夢(mèng)見自己都沒考好，讓他大汗淋漓。這個(gè)事例充分說明，考試對(duì)于學(xué)生影響的深遠(yuǎn)性。3.社會(huì)因素農(nóng)村學(xué)生的活動(dòng)范圍較小，且缺乏與現(xiàn)代社會(huì)的緊密接觸和聯(lián)系，但是這并不表明他們不向往走向社會(huì)，走向城市。但是從小在農(nóng)村生活的他們，對(duì)于復(fù)雜的社會(huì)也缺乏正確的認(rèn)識(shí)，因此也造成了不好的影響，具體表現(xiàn)在以下方面：（1）急劇變化的社會(huì)帶來的所沒有準(zhǔn)備好的沖擊。（2）不良社會(huì)媒介的傳播。（3）缺乏對(duì)“兩室一吧”引誘的抵制能力。以上幾個(gè)方面在內(nèi)與外沖擊著學(xué)生的內(nèi)心，再加上一些成人文化對(duì)青少年文化的不理解和傷害等多種因素的相互作用，造成這些學(xué)生的內(nèi)心豐富而又復(fù)雜不良的心理狀態(tài)，形成了一張張害人的無形之網(wǎng)，最終導(dǎo)致學(xué)生不良行為習(xí)慣的養(yǎng)成。發(fā)散性思維以其獨(dú)特性、變通性及流暢性使學(xué)生在作文構(gòu)思時(shí)獲得舉一反三、由此及彼并不落俗套的效果。作文教學(xué)中發(fā)散性思維的訓(xùn)練不但要傳授發(fā)散方法還應(yīng)該培養(yǎng)對(duì)發(fā)散方法進(jìn)行檢索與提取的能力。作文教學(xué)中發(fā)散性思維訓(xùn)練的目的在于讓思維能根據(jù)需要按一定的順序向各種方向運(yùn)動(dòng)，在發(fā)散過程中產(chǎn)生靈感，使寫作過程中的思維活動(dòng)可駕馭與可調(diào)控。從模仿入手，指導(dǎo)學(xué)生逐一掌握發(fā)散思維的方法。訓(xùn)練學(xué)生通過分析比較不同事物的相似點(diǎn)發(fā)散思維，我引導(dǎo)學(xué)生從學(xué)習(xí)趙麗宏的散文《峽谷》入手?！秿{谷》的構(gòu)思是在尋找不同事物的相似點(diǎn)中進(jìn)行的。作者捕捉住了自然界的“峽谷”與“社會(huì)生活――文化大革命――我們國(guó)家噩夢(mèng)般的大峽谷”的共同特點(diǎn)：難以逾越。告誡人們必須熱愛生命，熱愛生活，才能像江河沖出峽谷一樣戰(zhàn)勝生活中的種種“峽谷”模仿《峽谷》的構(gòu)思，要求學(xué)生在動(dòng)筆寫《大地與安泰》一文前從安泰離不開大地出發(fā)，尋找具有“離不開”這一相似點(diǎn)的不同事物。東山魁夷的《一片樹葉》，思緒從京都跳到家中的小院，由現(xiàn)在拉回過去；寫的內(nèi)容從櫻花到關(guān)于風(fēng)景畫的主張，到與前二者看似無關(guān)的“一片樹葉”整個(gè)思維活動(dòng)緊扣“珍重生命”這一主題擴(kuò)展，既不受空間限制，也不按時(shí)間順序，而是在自然景色的瞬息即逝卻周而復(fù)始與人類從自然的永恒中得到的慰安和感召的聯(lián)想中發(fā)散游動(dòng)，分析這些作品的結(jié)構(gòu)，學(xué)習(xí)作者發(fā)散思維的方法，可使學(xué)生思路活潑，浮想聯(lián)翩。除了逐步積累發(fā)散思維的方法，以供使用時(shí)檢索與提取，每一種思維方法應(yīng)分解成幾個(gè)步驟反復(fù)訓(xùn)練。巴金的《燈》由眼前到回憶；由自己到他人，由山那邊到古希臘。模仿“燈”的構(gòu)思，將作者的思維分解成下述幾個(gè)步驟，我指導(dǎo)學(xué)生寫題為《黑板》的抒情散文。“由眼前想到過去”，學(xué)生想到幼時(shí)父母教他識(shí)字的小黑板，小學(xué)里黑板上的加減乘除，中學(xué)里黑板上的分式、方程……從而得出“黑板是人生的搖籃”的認(rèn)識(shí)。“由此地想到彼處”，于是學(xué)生想到了學(xué)校長(zhǎng)廊上的，居委會(huì)門口的，醫(yī)院門診處的，法庭外的，食堂里的種種黑板報(bào)，于是又得出“黑板是社會(huì)萬花筒”的結(jié)論，并意識(shí)到自己從這不透明的窗口了解了生活的眾多方面。“由一般想到特殊”；學(xué)生想到戰(zhàn)爭(zhēng)年代八路軍戰(zhàn)士以石板代替黑板學(xué)習(xí)文化，想到《最后一課》中韓麥爾先生寫在黑板上的“法蘭西萬歲”于是發(fā)出了要珍惜現(xiàn)有條件的肺腑之言。在指導(dǎo)學(xué)生通過分析相同事物的不同點(diǎn)時(shí)，讀散文《枕木》我把指導(dǎo)學(xué)生思維發(fā)散的過程分解為二步。第一步是啟發(fā)學(xué)生找出枕木所有的特點(diǎn)：腳踏實(shí)地默默無聞；排列整齊有序伸延；承載重壓穩(wěn)如泰山……第二步是由這些不同的特點(diǎn)出發(fā)，尋求與其一致的精神狀態(tài)：默默無聞的奉獻(xiàn)精神；團(tuán)結(jié)協(xié)作的典范，大無畏精神的化身；――平凡中的偉大。一位同學(xué)在《擁抱大地的巨人――枕木》中寫道：“在我的眼中，枕木仿佛慢慢地豎起，有了眼睛，有了手，它們成人了！從戰(zhàn)爭(zhēng)年月那冰冷的河中‘浮’起的人橋到手拉手一起走向刑場(chǎng)的烈士；從揮著熱汗向大地掘油的老一代工人到今日擎著掘土機(jī)巨臂筑起楊高路的年輕一代。他們走過了硝煙彌漫的戰(zhàn)場(chǎng)，走過了灑滿全色光輝的油田。在血汗?jié)茶T的軌跡上，走向未來。這便是我們的民族。一個(gè)無比堅(jiān)強(qiáng)、無比團(tuán)結(jié)的民族，用無法抗拒的腳步，一步一步走著自己堅(jiān)實(shí)的路！”“既然我們都是這樣的枕木，就應(yīng)該毫不吝嗇，毫不猶豫地將自己奉獻(xiàn)給這條路”。發(fā)散性思維能力的強(qiáng)弱決定著作文能否立意新穎，感受獨(dú)特；構(gòu)思時(shí)能否浮想聯(lián)翩，思緒如天馬行空。這種思維發(fā)散活動(dòng)建立在知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)的積淀上，是思維操作方法系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。因此，在整個(gè)高中階段應(yīng)將發(fā)散思維方法的訓(xùn)練按單元有計(jì)劃地安排在各年級(jí)的作文教學(xué)中。發(fā)散思維方法可以按單元進(jìn)行教授。每單元教會(huì)一種發(fā)散方法，可分三個(gè)步驟進(jìn)行：（1）方法輔導(dǎo)。包括分析范文，了解思維發(fā)散的模式，并按此發(fā)散方法練習(xí)作文。（2）鞏固練習(xí)。重點(diǎn)為講評(píng)本單元所傳授的方法掌握運(yùn)用的情況。如寫作《橋啊，橋》一文，一位同學(xué)由面臨高初中難以銜接產(chǎn)生的苦惱希望能為自己建立一座橋，讓這座橋?qū)⑺蛩鶒?、所憧憬的理想的彼岸。文章的思路在今昔?duì)比中展開，在對(duì)未來的追求中延伸，文思如涌。講評(píng)既強(qiáng)化了方法指導(dǎo)，又激起“我也行”的自信，引導(dǎo)學(xué)生有意識(shí)地在寫作中再實(shí)踐。（3）鍛煉知識(shí)的遷移能力。重點(diǎn)為比較已教授過的幾種發(fā)散方法，培養(yǎng)運(yùn)用檢索與提取的能力，進(jìn)行綜合運(yùn)用的示范。每個(gè)單元要完成三――四篇作文。有的借助“相似點(diǎn)”發(fā)散思維，有的對(duì)比不同點(diǎn)，有的綜合運(yùn)用幾種方法，教學(xué)效果顯而易見?；蛑委熌[瘤策略及進(jìn)展6、露凝無游氛，天高風(fēng)景澈?；蛑委熌[基因治療腫瘤策略及進(jìn)展共69張課件基因治療腫瘤策略及進(jìn)展共69張課件基因治療腫瘤策略及進(jìn)展共69張課件基因治療腫瘤策略及進(jìn)展共69張課件區(qū)別幾個(gè)概念：將目的基因?qū)爰?xì)胞或細(xì)菌，針對(duì)目的基因叫做轉(zhuǎn)移（transfer）針對(duì)宿主細(xì)胞叫做轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）而這一過程叫做轉(zhuǎn)染（transfection）目的基因?qū)爰?xì)胞導(dǎo)致宿主細(xì)胞的基因組分級(jí)至性狀的改變叫做轉(zhuǎn)化（transformation）

6文檔之家-shop63695479.taobao/區(qū)別幾個(gè)概念：6文檔之家-shop63695479.taob第一節(jié)增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫——腫瘤疫苗的作用

抗腫瘤免疫有關(guān)的轉(zhuǎn)基因治療是腫瘤基因治療的最初方案。為增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別，免疫基因治療主要包括一、通過APC增強(qiáng)對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別與呈遞。二、增加腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子。三、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子。7文檔之家-shop63695479.taobao/第一節(jié)增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫——腫瘤疫苗的作用7文檔之家一、以樹突細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤抗原免疫

通過APC（AntigenPresentingCells）增強(qiáng)對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別與呈遞。將編碼目的抗原的基因，以重組表達(dá)載體的形式經(jīng)各種基因轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞，借用宿主細(xì)胞的表達(dá)加工機(jī)構(gòu)合成抗原分子。如通過主要組織相容性復(fù)合體（MajorHistocompatibilityComplex，MHC）Ⅰ和/或MHCⅡ類分子抗原處理和輸送途徑將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。8文檔之家-shop63695479.taobao/一、以樹突細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤抗原免疫8文檔之家-shop636二、細(xì)胞因子的免疫基因治療

將IL-1、IL-4、TNFα、IFN等細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使瘤細(xì)胞表達(dá)出相應(yīng)的抗原，隨后激發(fā)CD4+毒性T淋巴細(xì)胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)反應(yīng)，而導(dǎo)致分泌腫瘤抗原的靶細(xì)胞溶解，以達(dá)到治療腫瘤的目的。如Shiau等在體內(nèi)給予表達(dá)干擾素-γ的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行鼠膀胱癌切除后的免疫基因治療,其目的是增加腫瘤細(xì)胞在局部產(chǎn)生干擾素-γ,以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)達(dá)到治療目的。這種能產(chǎn)生細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因瘤細(xì)胞具有腫瘤疫苗的作用，這種腫瘤疫苗有替代無效的輔助性Ｔ細(xì)胞（HelperTLymphocyte，TH）的作用，并對(duì)機(jī)體內(nèi)遠(yuǎn)處的腫瘤具有抑制作用。9文檔之家-shop63695479.taobao/二、細(xì)胞因子的免疫基因治療9文檔之家-shop636954

將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞（TumorInfiltratingLymphocyte，TIL）和淋巴因子激活的殺傷性細(xì)胞（LymphokineActivatedKillercell，LAK細(xì)胞），使之活化，活化的TIL具有顯著抗自身腫瘤作用?；剌旙w內(nèi)后趨向于腫瘤局部聚集，并大量表達(dá)其攜帶能增強(qiáng)抗腫瘤免疫的細(xì)胞因子基因產(chǎn)物。Hull等比較了伴有IL-12和共刺激分子B7-1（AdmIL12/B7）兩個(gè)載體表達(dá)的腺病毒和單純伴有IL-12/B7（AdmIL-12）表達(dá)的腺病毒感染具有較差免疫原性的RM-9鼠前列腺癌模型，研究發(fā)現(xiàn)在感染的RM-9鼠腫瘤細(xì)胞中AdmIL-12/B7能介導(dǎo)IL-12分泌和增加B7-1在細(xì)胞表面的表達(dá),通過在比較體內(nèi)注射AdmIL-12/B7、AdmIL-12和對(duì)照組的療效比較顯示前者能明顯的減少腫瘤體積和增加鼠的存活率。使用兩個(gè)載體的腫瘤治療將濾過更多CD4+CD8+的免疫反應(yīng)細(xì)胞。10文檔之家-shop63695479.taobao/將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞（Tu三、共刺激分子的作用

將MHCⅠ、Ⅱ類抗原基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞為“異己”，以誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)?？梢娀蛎庖呔C合了減毒疫苗和亞單位疫苗的精髓，既象接種了活的病原體可以不斷地表達(dá)抗原蛋白，又可以方便地精選所需基因片段，以激發(fā)理想的免疫反應(yīng)。Matubonis等研究的結(jié)果表明，某些腫瘤細(xì)胞APC表面存在有共刺激分子B7-16（CD80）表達(dá)時(shí)，更難有效地激活CTL，基因疫苗激活的CTL具有高度的特異性和MHC-I類分子限制性，其目的在于排除細(xì)胞外蛋白與核酸的侵襲，這對(duì)防止殺傷作用的擴(kuò)散及維持機(jī)體核酸物質(zhì)的穩(wěn)定具有重要意義。11文檔之家-shop63695479.taobao/三、共刺激分子的作用11文檔之家-shop63695479

應(yīng)用這一手段前提是必須有腫瘤抗原的存在，特別是腫瘤特異性抗原，只有這樣才可使誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)只針對(duì)腫瘤而不破壞正常組織。以往尋求腫瘤特異性抗原，先從尋找癌基因開始，然后再?gòu)幕蛲茖?dǎo)肽片斷，近年來發(fā)展了一個(gè)原來方法相反的研究路線，即先分離可識(shí)別腫瘤特異性肽的CTL，再通過CTL尋找其編碼肽的基因。通過這種方法，發(fā)現(xiàn)了黑色素瘤基因MAGE-1，其編碼的抗原可為人類黑色素瘤的特異性T細(xì)胞所識(shí)別。

12文檔之家-shop63695479.taobao/應(yīng)用這一手段前提是必須有腫瘤抗原的存在，特別

HuXueyou等合成了MAGE·AL九肽，負(fù)載自體APC后給病人免疫，發(fā)現(xiàn)可引起原位和遠(yuǎn)距離部位的自體黑色素瘤反應(yīng)和特異性CTL數(shù)量增加，說明此法可誘導(dǎo)肽特異性CTL應(yīng)答并進(jìn)行循環(huán)。這一研究結(jié)果為特異性抗黑色素瘤的免疫治療顯示了良好的應(yīng)用前景。

免疫基因治療有助于克服抗癌治療中碰到的腫瘤異質(zhì)性、化療耐受性、腫瘤細(xì)胞低免疫原性等困難。13文檔之家-shop63695479.taobao/HuXueyou等合成了MAGE·AL九肽

第二節(jié)恢復(fù)和增強(qiáng)抑癌基因的功能——引入抑癌基因

抑癌基因是抗腫瘤基因治療中一類極為重要的目的基因，將這類基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物通過復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)或活化代謝機(jī)制，能抑制腫瘤的惡性生長(zhǎng)，甚至可導(dǎo)致癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。雖然腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟形成的過程，但在這些過程中某種癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了關(guān)鍵性的作用。14文檔之家-shop63695479.taobao/第二節(jié)14文檔之家-shop636954

用基因替代等方法恢復(fù)或增強(qiáng)抑癌基因雜合性的缺失，將某些含有抑癌基因的染色體片斷或整條染色體臂導(dǎo)入那些已知或疑有抑癌基因缺失的腫瘤細(xì)胞或荷瘤動(dòng)物體內(nèi)，以消除腫瘤細(xì)胞的惡性表型和在體內(nèi)致癌性，從而達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞異常生長(zhǎng)的目的?；蛑委熀兔庖叩陌刑禺愋苑肿又委熞堰M(jìn)入臨床研究階段。如通過載有野生型P53的腺病毒載體進(jìn)行瘤體內(nèi)注射。這種用病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤抑制基因治療方法代表了癌癥治療的策略之一。用腫瘤抑制基因如P53、Rb治療因那些有這類基因突變的腫瘤是有價(jià)值的。15文檔之家-shop63695479.taobao/用基因替代等方法恢復(fù)或增強(qiáng)抑癌基因雜合性的缺

體外轉(zhuǎn)導(dǎo)抑癌基因?qū)盒阅[瘤特征的影響有：轉(zhuǎn)導(dǎo)WT、p53能使結(jié)腸癌、骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腺癌增殖降低；轉(zhuǎn)導(dǎo)Rb基因能使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；轉(zhuǎn)導(dǎo)wT-1能使裸鼠體內(nèi)wilms’瘤形成下降；轉(zhuǎn)導(dǎo)NF1能使神經(jīng)纖維瘤病病灶減少；增加p16基因能使裸鼠體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成減少。16文檔之家-shop63695479.taobao/體外轉(zhuǎn)導(dǎo)抑癌基因?qū)盒阅[瘤特征的影響有：16文

在實(shí)體腫瘤中抑癌基因P53分子對(duì)由化療引起的DNA損傷有重要的作用,可引起細(xì)胞周期停滯與促使細(xì)胞凋亡，在食道癌研究中已獲療效。自從1994年Okamato等構(gòu)建含有p16INK4cDNA的表達(dá)載體pCMV-p16，成功地轉(zhuǎn)染p16INK4基因缺失的肺癌細(xì)胞系Calu-6和卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3，抑制了瘤細(xì)胞株的集落形成率，并使瘤細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)得到控制。此后，在頭頸部癌、卵巢癌中用腺病毒介導(dǎo)野生型P53去消除P53的突變，取得一定的療效。

17文檔之家-shop63695479.taobao/在實(shí)體腫瘤中抑癌基因P53分子對(duì)由化療引起

Nakamura等用野生型P53腫瘤抑制基因替代療法對(duì)結(jié)腸癌的治療已在臨床前期研究中獲得成功，還有待于臨床階段的進(jìn)一步工作證明。Schrump等對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌系，F(xiàn)ueyo、Higashi等分別對(duì)不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行p16INK4基因替代治療研究，證明p16INK4基因的替代治療可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種抑制作用是有選擇的，對(duì)Rb基因缺失以及p16INK4基因正常的腫瘤細(xì)胞無明顯抑制作用。18文檔之家-shop63695479.taobao/Nakamura等用野生型P53腫瘤抑制基

在研究中人們還發(fā)現(xiàn)p16INK4基因正常的癌細(xì)胞株往往都有p53基因異常，p53基因正常的癌細(xì)胞株常有p16INK4基因變異，同時(shí)伴隨cyclinD1的過度表達(dá)。因此，p16INK4基因與其它基因聯(lián)合治療將能更好地抑制腫瘤。Sandig等用p53-p16重組病毒注射到患肝癌的小鼠中，腫瘤生長(zhǎng)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，提示了引入抑癌基因在腫瘤治療中的前景。19文檔之家-shop63695479.taobao/在研究中人們還發(fā)現(xiàn)p16INK4基因正常的癌細(xì)第三節(jié)阻斷癌基因功能--反義核酸RNA干擾技術(shù)

細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)受到嚴(yán)格控制。ras、myc、src這一類癌基因由于突變而使其功能處于異?；钴S狀態(tài)，不斷地激活細(xì)胞內(nèi)正性調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)傳遞通路，促使細(xì)胞異常生長(zhǎng)。因此基因治療思路也可以將癌基因反義序列導(dǎo)入癌細(xì)胞來拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，阻止癌基因功能。20文檔之家-shop63695479.taobao/第三節(jié)阻斷癌基因功能--反義核酸RNA干擾技術(shù)20文檔

反義核酸技術(shù)的基本原理是根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)的規(guī)律設(shè)計(jì)出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的DNA或RNA，以影響其靶基因的表達(dá)，抑制其功能。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，為雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過程,是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)現(xiàn)象。

21文檔之家-shop63695479.taobao/反義核酸技術(shù)的基本原理是根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)

有關(guān)基因沉默現(xiàn)象最早的報(bào)道見于植物中。1995年Gou等在對(duì)線蟲的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),正義RNA與反義RNA一樣可以阻斷par-1基因的表達(dá),但作者對(duì)這一現(xiàn)象沒有進(jìn)行更深入的研究。1998年,Fire等首次將正義鏈和反義鏈的RNA結(jié)合物———雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默,每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA就足以完全阻斷同源基因的表達(dá)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還證實(shí),在線蟲體內(nèi)注入雙鏈RNA,不但可以阻斷整個(gè)線蟲的所有同源基因的表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第1代子代的同源基因沉默,他們將這種現(xiàn)象命名為RNAi。此后，在多種生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象,22文檔之家-shop63695479.taobao/22文檔之家-shop63695479.tao

許多學(xué)者認(rèn)為,在生物中廣泛存在的PTGS現(xiàn)象可視作不同物種所共有的適應(yīng)保護(hù)機(jī)制:通過阻抑大量的異常mRNA表達(dá),抵抗轉(zhuǎn)座子和病毒的侵襲,以保護(hù)機(jī)體免于受損,相當(dāng)于基因組的免疫系統(tǒng)；通過調(diào)節(jié)編碼蛋白基因的表達(dá)起到調(diào)控生命活動(dòng)的作用。RNAi在哺乳動(dòng)物中的研究主要集中在干擾病毒在體內(nèi)的復(fù)制、抑制癌基因表達(dá)及基因敲除后基因功能的研究等方面。23文檔之家-shop63695479.taobao/許多學(xué)者認(rèn)為,在生物中廣泛存在的PTGS現(xiàn)象可視作與傳統(tǒng)的基因研究方法—基因敲除、定點(diǎn)突變、反義核酸及核酶技術(shù)等相比，RNAi具有以下五大特點(diǎn)：基因序列特異性；dsRNA的穩(wěn)定性；沉默信號(hào)傳遞性；Knock-down高效性；RNAi效用濃度依賴性。24文檔之家-shop63695479.taobao/與傳統(tǒng)的基因研究方法—基因敲除、定點(diǎn)突變、反義核酸及核酶技術(shù)一、RNAi的分子機(jī)制

外源性(如病毒)或內(nèi)源性的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與一種RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸內(nèi)切酶)Dicer結(jié)合,隨即被切割成21～23nt的帶有3’端單鏈尾巴及磷酸化5’端的短鏈dsRNA,即小干擾RNA（smallinterfereingRNA,siRNA）。siRNA與Dicer形成RNA引導(dǎo)沉默的復(fù)合體(RNAinducessilencingcomple,RISC)。siRNA作為引導(dǎo)序列,按照堿基互補(bǔ)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA,并引導(dǎo)RICS結(jié)合mRNA。隨后siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位,核酸酶Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段,特異性地抑制靶基因的表達(dá)。而新產(chǎn)生的dsRNA片段可再次形成RISC,繼續(xù)降解mRNA,從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。因此,每個(gè)細(xì)胞只需要幾個(gè)siRNA分子就能夠引起強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。此外,siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp)的作用下進(jìn)行大量擴(kuò)增,并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,使RNAi擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可以傳代。

25文檔之家-shop63695479.taobao/一、RNAi的分子機(jī)制25文檔之家-shop6369547926文檔之家-shop63695479.taobao/26文檔之家-shop63695479.taobao/闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾研究中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。達(dá)到這一目的有幾種途徑：⑴利用質(zhì)粒載體或病毒載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出能與目的基因正義RNA相互補(bǔ)的反義RNA，從而阻斷目的基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。⑵

體外人工合成反義寡聚核苷酸。由于脫氧核苷酸的合成較容易，在體液中也比較穩(wěn)定，而脫氧核苷酸也同樣可以與RNA相互配對(duì)結(jié)合，所以在實(shí)踐中多用反義核苷酸（antisenseoligodeoxyribonucleotide,AS-ODN）。與蛋白質(zhì)水平相比，從遺傳水平抑制基因表達(dá)能更有效地阻斷疾病的發(fā)生發(fā)展。

27文檔之家-shop63695479.taobao/闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾二、RNAi在腫瘤治療中的意義ras基因包括K-ras、H-ras、N-ras,是鳥苷酸結(jié)合蛋白,對(duì)細(xì)胞的繁殖、分化和細(xì)胞生存起調(diào)控作用。ras基因突變可使之處于長(zhǎng)期激活GTP結(jié)合狀態(tài),易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。K-ras基因在人類腫瘤中最普遍活化狀態(tài)的致癌基因，在腫瘤組織中的突變率30-50%，在胰腺癌中高達(dá)85%。突變的Ras基因與正常細(xì)胞中的野生型ras基因通常只有一個(gè)堿基的不同，但由于RNAi的高度特異性，可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞中突變的ras基因產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的野生型ras不產(chǎn)生抑制作用。

28文檔之家-shop63695479.taobao/二、RNAi在腫瘤治療中的意義28文檔之家-shop6369最近Li-MoChen等報(bào)道建立K-rasV12突變基因的siRNA腺病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Panc-1胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型。WeiWang等通過構(gòu)建K-ras基因的siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassette,SEC)成功抑制胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2的K-ras表達(dá)。Fleming等報(bào)道，利用化學(xué)合成anti-K-ras-siRNA抑制了PANC-1和MaiPaca-2胰腺癌細(xì)胞K-ras的表達(dá)，并觀測(cè)到集落形成能力、細(xì)胞增殖能力和侵襲能力降低、凋亡增加，與VEGF）和血小板反應(yīng)素（thrombspondin-1，TSP-1）基因和c-myc的下游調(diào)控元件、與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucosuetransporter，GLUT-1）基因表達(dá)變化。

29文檔之家-shop63695479.taobao/最近Li-MoChen等報(bào)道建立K-rasV12突變基因的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球蛋白超家族的成員，在許多腫瘤中都有表達(dá)，對(duì)腫瘤的形成、抵抗“失巢凋亡”（anoikis：正常內(nèi)皮細(xì)胞或表皮細(xì)胞黏附不適宜的基質(zhì)時(shí)引起細(xì)胞凋亡的一種現(xiàn)象）和形成轉(zhuǎn)移起到重要作用。DuxburyMS等通過化學(xué)合成anti-CEARAM6-siRNA抑制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞株的CEARAM6的表達(dá)，觀察到失巢凋亡抵抗性的減弱以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)、外模型中轉(zhuǎn)移能力的降低。他們還分別利用逆轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達(dá)載體和化學(xué)合成的方法介導(dǎo)了對(duì)CEARAM6基因高表達(dá)BXPC3胰腺癌細(xì)胞株CEARAM6基因的敲減,觀測(cè)到腫瘤細(xì)胞侵襲能力降低、轉(zhuǎn)移瘤生成能力下降，進(jìn)一步證明了CEARAM6基因在腫瘤形成、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，為腫瘤的RNAi治療提供了作用靶點(diǎn)。

30文檔之家-shop63695479.taobao/癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球蛋白超家BCR/ABL融合基因是定位于人9q34上的C-ABL基因和22q11上的BCR基因發(fā)生t(9:22)易位，使相應(yīng)無關(guān)的基因發(fā)生融合而形成，它是PH染色體的分子基礎(chǔ)，在CML發(fā)病中起到重要作用。Borkhardt等采用RNAi技術(shù)成功地抑制了K562白血病細(xì)胞中的BCR/ABL融合基因mRNA的表達(dá)，增加對(duì)K562白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，但在聯(lián)合ABL酪氨酸抑制劑--Imatinib治療時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡沒有相加作用。

31文檔之家-shop63695479.taobao/BCR/ABL融合基因是定位于人9q34上的C-ABL基因和RNAi技術(shù)的快速發(fā)展必將推動(dòng)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大步前進(jìn)。RNAi在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也必將為各種疾病尤其是腫瘤等疾病的根治帶來希望。但是,從目前RNAi的研究現(xiàn)狀來看,在哺乳動(dòng)物中,RNAi并不能完全阻斷基因的表達(dá),尤其是異常高表達(dá)的基因,這將促使人們?nèi)ヌ剿餮芯啃碌母咝iRNA表達(dá)載體體系。為了促進(jìn)基于RNAi的基因藥物進(jìn)入臨床研究和應(yīng)用,大量的研究已集中到提高siRNA分子的工業(yè)化生產(chǎn)能力、增加siRNA分子穩(wěn)定性、開發(fā)siRNA藥物的靶向傳遞系統(tǒng)等方面。盡管如此,RNAi在癌癥治療中的應(yīng)用已經(jīng)取得非常大的成就,因此我們有理由相信RNAi必將對(duì)癌癥的最終根治起到重要的作用。

32文檔之家-shop63695479.taobao/RNAi技術(shù)的快速發(fā)展必將推動(dòng)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大步前進(jìn)。RNA第四節(jié)核酶用于基因治療

1983年美國(guó)Cech和Altmann發(fā)現(xiàn)并鑒定了一類具有酶催化作用的核苷酸片斷，稱為核酶(Ribozyme)。這一發(fā)現(xiàn)使酶的概念從蛋白領(lǐng)域擴(kuò)展到核酸領(lǐng)域。核酶具有核苷酸內(nèi)切酶的活性，它能在無蛋白質(zhì)的條件下切割靶RNA分子。

33文檔之家-shop63695479.taobao/第四節(jié)核酶用于基因治療

33文

核酶用于基因治療的條件是

①找出腫瘤發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵性的蛋白質(zhì)；②這種蛋白的氨基酸序列（和編碼基因序列）必須是已知的，以便設(shè)計(jì)核酶的切割位點(diǎn)；③所設(shè)計(jì)的核酶必須能夠切割靶RNA；④腫瘤細(xì)胞必須能攝取這種核酶，并能在細(xì)胞內(nèi)切割靶RNA。34文檔之家-shop63695479.taobao/核酶用于基因治療的條件是34文檔之家-shop

反義治療并不像剛開始人們所想像的那么簡(jiǎn)單，目前還有許多關(guān)鍵性問題有待去解決，如生物學(xué)穩(wěn)定性，藥物的釋放系統(tǒng)，以及由序列特異性和非特異性所引起的作用包括毒副作用等。應(yīng)用反義技術(shù)進(jìn)行腫瘤基因治療最常用的靶基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及編碼端粒酶基因，或端粒酶的RNA部分。

35文檔之家-shop63695479.taobao/反義治療并不像剛開始人們所想像的那么簡(jiǎn)單，目第五節(jié)抗腫瘤血管生成的基因治療

腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與新生血管的形成密切相關(guān),由于腫瘤的血管生成受到血管生長(zhǎng)因子、血管生長(zhǎng)抑制因子以及其它的因子的共同調(diào)控,因此通過阻斷促血管生長(zhǎng)因子作用或者強(qiáng)化血管生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)均可達(dá)到治療的目的。

36文檔之家-shop63695479.taobao/第五節(jié)抗腫瘤血管生成的基因治療36文檔之家-shop63一、阻斷血管生長(zhǎng)因子的作用

主要是采用反義DNA、中和性抗體、受體酪氨酸激酶的抑制劑以及核酶等。用腺病毒載體介導(dǎo)的VEGF的拮抗物輸入鼠卵巢癌抑制VEGF的活性；利用含有VEGFcDNA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞,用以拮抗VEGF的促血管生成作用；用抗VEGF的核酶抑制VEGF的表達(dá),使卵巢癌生長(zhǎng)及血管生成減少的報(bào)告。針對(duì)其它的血管生成因子的治療,如bFGF,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF),EGF,PDGF,PDECGF,IGF,Ets-1,HGF等的因子的治療。

37文檔之家-shop63695479.taobao/一、阻斷血管生長(zhǎng)因子的作用37文檔之家-shop636954Zhang等用VEGFsiRNA特異性地抑制VEGF的表達(dá),成功地抑制小鼠卵巢癌上皮ID8細(xì)胞的增殖。TSP1是一種血管抑制因子,它可以抑制mmp9基因的激活,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。一般說來,腫瘤細(xì)胞能夠通過抑制TSP1的表達(dá)來達(dá)到其指數(shù)增殖的目的。通常情況下,VEGF能夠抵制TSP1的血管生長(zhǎng)抑制作用。Filleur等用VEGFsiRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)VEGFsiRNA抑制效應(yīng)可以與分泌TSP1的腫瘤細(xì)胞協(xié)同作用,抑制腫瘤的生長(zhǎng),并且VEGFsiRNA能阻止TSP1耐受細(xì)胞的出現(xiàn),并極大地抑制了這些細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。

38文檔之家-shop63695479.taobao/Zhang等用VEGFsiRNA特異性地抑二、上調(diào)血管生長(zhǎng)抑制因子用重組血管抑素cDNA輸入消化道腫瘤可取得較好的治療效果,用編碼內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體可抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和VEGF介導(dǎo)的血管生成,病毒載體介導(dǎo)的重組編碼PF4的反義基因顯示出抗鱗癌血管生長(zhǎng)的作用。

39文檔之家-shop63695479.taobao/二、上調(diào)血管生長(zhǎng)抑制因子39文檔之家-shop6369547三、抑制細(xì)胞外基質(zhì)和基膜降解以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞特異性粘附分子的作用用腺病毒載體介導(dǎo)的T1MP-1基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,瘤細(xì)胞產(chǎn)生的T1MP-1抑制了MMP-2,MMP-9的活性,使內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到抑制。Gondi等采用雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的反義uPAR和uPA治療膠質(zhì)瘤,明顯抑制了腫瘤的血管生成。

40文檔之家-shop63695479.taobao/三、抑制細(xì)胞外基質(zhì)和基膜降解以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞特異性粘附分子的第五節(jié)、加大腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的天然差別——自殺基因治療自殺基因（suicidegene）治療思路就是人為地改變腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)，將一些“自殺基因”(TK基因、CD基因和較新的細(xì)胞色素p450-2B1基因)轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，這些基因所表達(dá)的產(chǎn)物能將原先對(duì)細(xì)胞無毒或相對(duì)低毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，而引起到殺傷細(xì)胞的作用。

41文檔之家-shop63695479.taobao/第五節(jié)、加大腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的天然差別41文檔之家-sh一、旁觀者效應(yīng)與機(jī)制1、旁觀者效應(yīng)(bystandereffect)幾乎所有的自殺基因系統(tǒng)都具有旁殺傷效應(yīng)，即不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的細(xì)胞可以被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的細(xì)胞亦可被殺死。研究發(fā)現(xiàn)旁殺傷效應(yīng)一般是1：10，即一個(gè)基因修飾細(xì)胞死亡時(shí)帶動(dòng)10個(gè)基因未修飾細(xì)胞死亡，由此可見“旁觀者效應(yīng)”明顯擴(kuò)大了自殺基因的殺傷作用。2、旁觀者效應(yīng)的可能機(jī)制⑴磷酸化的巰基通過縫隙連接在同類細(xì)胞間傳遞；⑵自殺基因（TK-GCV）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡表現(xiàn)為凋亡，臨近未轉(zhuǎn)染細(xì)胞吞噬凋亡小體，而凋亡小體內(nèi)含有GCV三磷酸代謝產(chǎn)物；⑶自殺基因可使腫瘤從免疫抑制轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖叽碳?，包括各種細(xì)胞因子釋放和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；⑷

死亡細(xì)胞中抗原暴露，被周圍APC攝取而產(chǎn)生抗腫瘤免疫。

42文檔之家-shop63695479.taobao/一、旁觀者效應(yīng)與機(jī)制42文檔之家-shop63695479.二、靶向基因表達(dá)和治療應(yīng)用自殺基因進(jìn)行基因治療時(shí)，首先要求轉(zhuǎn)染的自殺基因要有一定的表達(dá)效率。其次，導(dǎo)入的基因要局限于靶細(xì)胞，常用的病毒載體導(dǎo)入法能較好地解決這個(gè)問題。增加病毒載體靶向性的一種重要策略就是利用腫瘤特異性調(diào)控元件去調(diào)節(jié)自殺基因的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有特異性轉(zhuǎn)錄激活因子，能激活特定蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄激活的作用是通過結(jié)構(gòu)基因上游的特異性調(diào)控序列起作用，正常細(xì)胞內(nèi)無此類特定的轉(zhuǎn)錄激活因子。因此，當(dāng)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都被轉(zhuǎn)染特異調(diào)控序列控制的外源性目的基因后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性調(diào)控序列可被激活，表達(dá)目的基因，從而達(dá)到靶向基因表達(dá)和治療的目的，正常細(xì)胞則不能表達(dá)。

43文檔之家-shop63695479.taobao/二、靶向基因表達(dá)和治療43文檔之家-shop63695479在各種調(diào)控序列中，組織特異性啟動(dòng)子常被用作啟動(dòng)目的基因在靶組織中高度表達(dá)，如甲胎蛋白基因啟動(dòng)子（pAFP）、癌胚抗原啟動(dòng)子（pCEA）、白蛋白啟動(dòng)子（pALB）、骨鈣化蛋白啟動(dòng)子（pUL）、前列腺特異抗原啟動(dòng)子（psA）等。如使用新型的載體KD1-SPB[KD1是伴有代替表面活性蛋白B（surfactantproteinBSPB）的E4促動(dòng)子]，在成熟Ⅱ型肺泡上皮和支氣管上皮癌中SPB促動(dòng)子的活性受到限制，因?yàn)镵D-SPB中有E1A突變，因此它僅能作用于肺和支氣管的癌細(xì)胞。KD1-SPB在肝癌治療中抑制腫瘤生長(zhǎng)。表明腺病毒載體在癌治療中能針對(duì)組織特異性腫瘤具有選擇性的復(fù)制能力。

44文檔之家-shop63695479.taobao/在各種調(diào)控序列中，組織特異性啟動(dòng)子常被用作啟動(dòng)目的基因在靶組三、將“毒性”基因?qū)肽[瘤細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞

這些基因通常編碼的是一種酶，這種酶可使無毒的前藥轉(zhuǎn)化為有毒的代謝產(chǎn)物，從而使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此通常也稱為酶/前藥系統(tǒng)。最近，Nagy等在實(shí)驗(yàn)兔中使用逆轉(zhuǎn)錄的單純皰疹病毒胸苷激酶基因（Herpessimdexvirus-thymidinekinaseHSV-TK）作為自殺基因治療卵巢癌能引起該腫瘤退化。HSV－TK可使核苷類似物磷酸化，然后代替核苷整合到DNA鏈中，從而使細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入HSV－TK后，高表達(dá)TK，使細(xì)胞內(nèi)毒性產(chǎn)物集聚而死亡。在不到20％的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入TK后，用前藥GCV會(huì)引起80％的腫瘤細(xì)胞死亡這是旁觀者效應(yīng)所引起的。

45文檔之家-shop63695479.taobao/三、將“毒性”基因?qū)肽[瘤細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞45文檔之家-sh

我國(guó)學(xué)者顏?zhàn)臃f利用AFP基因上游調(diào)控序列構(gòu)建了一種肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的EB病毒復(fù)制子載體，成功地實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移的靶向性。由于腦的神經(jīng)細(xì)胞已高度分化，只有腫瘤細(xì)胞處于活化分裂狀態(tài)，因此腦腫瘤是自殺基因較理想的靶器官，對(duì)于腦腫瘤中最常見的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中，HSV-TK/GCV首先由美國(guó)NFH的Ram及Calver小組于1992年報(bào)道，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物腦腫瘤中非常理想，于1992年7月獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。46文檔之家-shop63695479.taobao/我國(guó)學(xué)者顏?zhàn)臃f利用AFP基因上游調(diào)控序列構(gòu)建了

國(guó)內(nèi)也有報(bào)道用大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminaseCD）自殺基因系統(tǒng)治療膠質(zhì)瘤。CD僅存在真菌與細(xì)菌中哺乳類動(dòng)物無，CD可將胞嘧啶脫氨基變?yōu)槟蜞奏?，可?-Fc脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?-Fu，而5-Fu作為化療藥物抑制DNA合成，CD基因是第二個(gè)用于人體的腫瘤自殺基因。47文檔之家-shop63695479.taobao/國(guó)內(nèi)也有報(bào)道用大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cy

HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)還常常用于成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，腦膜轉(zhuǎn)移瘤等腦腫瘤的治療。此外，自殺基因治療也普遍應(yīng)用于肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、腹膜癌等腫瘤的治療中，它對(duì)那些惡性易復(fù)發(fā)、療效差和無法根治的腫瘤是一種較為理想的治療方法。

48文檔之家-shop63695479.taobao/HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)還常常用四、自殺基因與免疫基因的聯(lián)合治療將產(chǎn)生更好的療效研究發(fā)現(xiàn)單用HSV-TK/GCV治療，可使腫瘤比對(duì)照組小5倍以上，而聯(lián)用IL-2基因或IL-12基因能使腫瘤完全消失并抑制轉(zhuǎn)移。將IL-2基因、GM-CSF基因和HSV-TK基因三者合用可取得更好的效果。IFN-α基因與HSV-TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合治療，可使70%以上的鼠白血病腫瘤消退，并明顯延長(zhǎng)鼠成活時(shí)間，而單純IFN-α只延長(zhǎng)鼠成活時(shí)間，不能使腫瘤消退，單純HSV-TK/GCV只暫時(shí)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和略微延長(zhǎng)鼠成活時(shí)間。49文檔之家-shop63695479.taobao/四、自殺基因與免疫基因的聯(lián)合治療將產(chǎn)生更好的療效49文檔之家自殺基因治療對(duì)免疫功能的激發(fā)作用①誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）；②誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌（IL-1、TNF-α、IL-1α、IL-6、mRNA在治療后第2天開始表達(dá),而IFN-γ、GM-CSF在治療后第2天開始表達(dá)，到治療后第4天仍有表達(dá)，其中以TNF-γ表達(dá)升高最明顯）。50文檔之家-shop63695479.taobao/自殺基因治療對(duì)免疫功能的激發(fā)作用50文檔之家-shop636第六節(jié)提高化療效應(yīng)——耐藥基因治療腫瘤化療中最難處理的問題之一

就是出現(xiàn)瘤細(xì)胞對(duì)許多常用化療藥物產(chǎn)生抗藥性和交叉抗藥性，有些腫瘤開始敏感，但經(jīng)過一段時(shí)間后出現(xiàn)耐藥性,這種耐藥性常表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗腫瘤藥物具有抵抗性,稱為多藥耐藥(multidrugeresistance,MDR)。

51文檔之家-shop63695479.taobao/第六節(jié)提高化療效應(yīng)——耐藥基因治療51文檔之家-shop自1970年Bieuler等首次報(bào)道交叉耐藥現(xiàn)象以來，針對(duì)腫瘤耐藥基因治療日益活躍，主要集中在兩個(gè)方面1、MDR的形成機(jī)制2、如何利用MDR基因來抵制晚期腫瘤患者化療時(shí)出現(xiàn)的骨髓抑制。

研究發(fā)現(xiàn),這種耐藥性與腫瘤細(xì)胞的某些耐藥基因相關(guān)。

多藥耐藥基因1(MDR1),編碼相對(duì)分子質(zhì)量為170000的跨膜糖蛋白P-gp/P-170。具有藥泵的作用,當(dāng)其表達(dá)增高或功能異常增強(qiáng)時(shí),能將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物“泵”出細(xì)胞外,使細(xì)胞能在高濃度的藥物環(huán)境中生存。針對(duì)該基因的RNAi可以使MDR1基因的水平下調(diào)，提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。

52文檔之家-shop63695479.taobao/自1970年Bieuler等首次報(bào)道交叉耐藥現(xiàn)象以來，針對(duì)腫Nieth等通過anti-MDR1-siRNA成功抑制了人胰腺癌細(xì)胞株（EPP85-181RDB）和胃癌細(xì)胞株（EPG85-257RDB）的MDR1基因及其表達(dá)產(chǎn)物,抑制效率達(dá)91%,兩種細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥性抵抗分別降低了58%和89%。表明此種siRNA也可以試用于腫瘤的治療,通過提高細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性來達(dá)到治療腫瘤的目的。

53文檔之家-shop63695479.taobao/Nieth等通過anti-MDR1-siRNA成功抑制了人一些應(yīng)用多藥耐藥基因（MDR1）轉(zhuǎn)染保護(hù)骨髓造血細(xì)胞的基因治療項(xiàng)目已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如將針對(duì)化療藥物的MDR轉(zhuǎn)染至腫瘤患者的骨髓造血干細(xì)胞(HemopoieticStimCell，HSC)，使其具有比腫瘤更強(qiáng)的化療藥物耐受力，可以提高臨床化療劑量和時(shí)間，而減輕化療最主要的副作用——對(duì)骨髓細(xì)胞的損害。臨床常用于骨髓未受侵犯的乳腺癌、卵巢癌和各種腦部腫瘤患者的治療，因?yàn)檫@些腫瘤細(xì)胞中較少檢測(cè)到內(nèi)在MDR1的表達(dá)，而且即使接觸MDR1的藥物，其表達(dá)水平仍明顯低于轉(zhuǎn)基因的造血細(xì)胞表達(dá)水平。54文檔之家-shop63695479.taobao/一些應(yīng)用多藥耐藥基因（MDR1）轉(zhuǎn)染保護(hù)骨髓造血細(xì)胞的基因治

據(jù)報(bào)道，20例晚期乳腺癌或卵巢癌患者經(jīng)此治療有8例獲完全緩解，9例獲部分緩解，完全緩解中位時(shí)間為10個(gè)月。一些新的耐藥基因，如突變的二氫葉酸還原酶（MDHFR）、甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、醛脫氫酶（ALDH）等被用于腫瘤耐藥基因的治療。通過用耐藥基因轉(zhuǎn)染保護(hù)骨髓造血細(xì)胞是一種特殊方式的腫瘤基因療法，用于克服化療的骨髓抑制作用效果顯著，臨床應(yīng)用潛力很大。55文檔之家-shop63695479.taobao/據(jù)報(bào)道，20例晚期乳腺癌或卵巢癌患者經(jīng)此治療

在腫瘤治療中多數(shù)抗癌藥物是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，而癌細(xì)胞的耐藥是化療中最棘手的問題。在報(bào)道中將BCl-2轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞則癌細(xì)胞變?yōu)槟退?，目前從凋亡角度來研究腫瘤的耐藥性，可能找到新的解決方法。56文檔之家-shop63695479.taobao/在腫瘤治療中多數(shù)抗癌藥物是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，而癌細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的檢測(cè)幫助臨床選擇有效的抗癌藥物

①胚胎型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GsTπ），是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的一種標(biāo)記，對(duì)順鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥，用于肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、食道癌治療。②

熱休克蛋白（HSPs）是細(xì)胞受應(yīng)激原刺激后產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，與腫瘤發(fā)生、增殖及分化有關(guān)。按其分子量有3種類型。HPS27與腫瘤耐藥和腫瘤分化有關(guān)，HPS60主要用于舌鱗癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌的研究，具有預(yù)后意義。HPS90可能參與細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)。

57文檔之家-shop63695479.taobao/多藥耐藥（MDR）的檢測(cè)幫助臨床選擇有效的抗癌藥物57文檔③P-糖蛋白（P-gP）是多藥耐藥（MDR）基因的產(chǎn)物，是轉(zhuǎn)膜蛋白，被稱為“藥物流出泵”，或“膜泵糖蛋白”，轉(zhuǎn)膜蛋白是個(gè)活躍的轉(zhuǎn)運(yùn)者，排出細(xì)胞內(nèi)毒物與藥物。通過ATP供能，將已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物的濃度，減少對(duì)細(xì)胞的毒性作用。P糖蛋白表達(dá)程度與耐藥程度成正比，與化療效果，生存期成反比。在原發(fā)性乳腺癌中P糖蛋白表達(dá)很低，但經(jīng)過治療后可升高，

這可能是由于細(xì)胞選擇性的耐受藥物，一旦有P基因擴(kuò)增，常伴有腫瘤進(jìn)展。現(xiàn)已表明一些鈣通道阻斷劑，如硝苯吡啶，

維拉帕米，異搏定和免疫抑制劑等均可轉(zhuǎn)化MDR表型，抑制P糖蛋白的膜泵作用，

增加癌細(xì)胞內(nèi)化療藥物的積聚，使抗癌藥物殺傷能力增強(qiáng)。P-gP易產(chǎn)生耐藥的抗癌藥物主要是長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿類和阿霉素。

58文檔之家-shop63695479.taobao/③P-糖蛋白（P-gP）是多藥耐藥（MDR）基因的產(chǎn)物，是④DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）在正常細(xì)胞DNA合成與分裂時(shí)起作用，是細(xì)胞周期S-G2-M期中敏感而特異的標(biāo)記，其含量高低與抗癌藥物的作用呈正比，是抗癌藥物的作用靶點(diǎn)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞TopoⅡ表達(dá)下降產(chǎn)生對(duì)TopoⅡ抑制劑類化療藥物（阿霉素及鬼臼乙叉甙等）產(chǎn)生耐藥。⑤

其它的耐藥預(yù)測(cè)物有：乳腺癌C-erbB-2過表達(dá)對(duì)含有環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的化療方案耐藥；N-myc表達(dá)增強(qiáng)的小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)化療缺乏反應(yīng)并進(jìn)展快速；Bcl-2耐藥機(jī)制為抗凋亡作用，高表達(dá)者對(duì)多數(shù)抗癌藥物、放射治療耐受。因此這方面的免疫組化檢測(cè)對(duì)腫瘤病人選擇化療方案和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。

59文檔之家-shop63695479.taobao/④DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）在正常細(xì)胞DNA合成與分第七節(jié)腫瘤基因治療研究面臨的主要問題

基因治療是21世紀(jì)治療惡性腫瘤的重要手段。一、基因?qū)氲妮d體系統(tǒng)目前所采用的載體主要分為轉(zhuǎn)染性和轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體。轉(zhuǎn)染性載體是利用化學(xué)或物理方法增加細(xì)胞膜的通透性而將DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi),包括脂質(zhì)體和基因槍等。轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體則是利用病毒對(duì)細(xì)胞的天然親和力把遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的方法相對(duì)簡(jiǎn)易,抗原性弱但效率較低,而且基因表達(dá)的持久性不夠。因此它在腫瘤基因治療中的使用受到限制。轉(zhuǎn)導(dǎo)法則效率高,作用持久,但抗原性較強(qiáng),目前大多數(shù)基因治療程序仍以病毒介導(dǎo)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是目前最為成熟、運(yùn)用最廣的進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)。

60文檔之家-shop63695479.taobao/第七節(jié)