《糧油檢測糧食中伏馬毒素B1、B2的測定超高效液相色譜方法》行業標準制定編制說明伏馬毒素（Fumonisins）是一組由串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、多育鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、輪狀鐮刀菌（Fusariumverticillioides）和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等產生的真菌毒素。迄今為止，已經鑒定到28種伏馬毒素類似物，它們被分為4組，即A，B，C和P組。B組伏馬毒素是野生型菌株中產生量最豐富的，其中FB1占了總量中的70%左右，同時FB1也是所有伏馬毒素中毒性最強的。可導致馬產生白腦軟化癥（ELEM）、神經性中毒，豬肺水腫，人類食管癌和肝癌等，國際癌癥研究機構（IARC）1993年將其歸為2B類致癌物。主要污染玉米及玉米制品，在大米、高粱、面條、啤酒中也有存在。目前報道用于伏馬毒素檢測的方法有酶聯免疫法、免疫膠體金試紙法、時間分辨熒光免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜質譜聯用法、薄層色譜法等。薄層色譜法由于操作復雜，目前應用較少；膠體金和酶聯免疫方法用于快速篩查;普通液相色譜方法目前應用較多，但分析速度較慢，耗費溶劑較多，成本增加；液質聯用儀檢測需要高端的質譜儀。當前急需建立一種更加靈敏、高效、低溶劑量的伏馬毒素微量快速定量方法。為了滿足當前我國糧食綠色檢測、監測定量分析的需要，通過查閱文獻，根據范德米特(vanDeemeter)方程理論，結合免疫親和凈化手段，基于快速高效色譜分離技術，建立了一種進樣量小、分離度高、快速準確、環保的伏馬毒素定量分析方法。本標準項目的研究有助于提高糧食樣品檢測、監測效率，降低成本，保護環境，保障從業人員健康安全。本標準對后續標準制定，以及糧食污染黃曲霉毒素的相關科研、標準制定起到較好的指導、參考、促進作用。1工作簡況1.1任務來源及起草單位根據2012年糧油行業標準制定計劃的要求，由國家糧食局科學研究院負責《糧油檢測糧食中伏馬毒素B1、B2的測定超高效液相色譜法》起草工作，該方法也是國家863項目“糧食產后生物性危害物快速檢驗監測技術”（項目編號2012AA101609）的研究內容之一。起草單位成立的標準起草組負責進行本標準的各項工作。1.2標準研制主要工作過程（1）根據該標準的特點，2012年5月-2012年7月，查詢了國內外資料，對相關檢測機構、糧庫、糧食加工企業進行了調研，并召開了第一次討論會，確定了標準制訂方案和工作計劃。（2）2012年8月-2012年12月，在國家糧食局科學研究院實驗室進行標準的研制工作，主要包括方法的建立，方法靈敏度測試，方法的線性范圍確定，方法的回收率研究等。（3）2013年1月-3月，編寫了《糧油檢測糧食中伏馬毒素B1、B2的測定超高效液相色譜法》標準草案，并召開了第二次討論會。（4）2013年4月-9月，在不同廠家的快速液相色譜上進行方法的驗證。（5）2013年10月-11月，標準草案的意見征詢。（6）2015年3月-2015年7月，行業驗證。(7)2015年8月-至今，標準文本修改,形成送審稿。2標準的編制原則和標準的主要內容2.1標準編制原則本標準是根據GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構與編寫規則》、GB/T20001.4-2009《標準編寫規則第4部分：化學分析方法》的規定進行編制的。2.2確定標準主要內容2.2.1標準的適用范圍本標準規定了采用免疫親和柱凈化快速高效液相色譜法測定谷物及其制品中伏馬毒素的條件和詳細分析步驟。本標準適用于小麥、玉米、稻谷等糧食及其制品中伏馬毒素的測定。本標準方法伏馬毒素B1、B2的檢出限為0.05mg/kg。2.2.2標準研制的總體思路儀器與試劑快速高效液相色譜儀：配備熒光檢測器和數據處理系統。色譜柱：C18柱（50mm×3mm，1.7μm,或相當者）。黃曲霉毒素免疫親和柱；玻璃纖維濾紙；0.22μm有機濾膜；6位泵流操作架；電子分析天平；高速旋轉粉碎機；高速均質器；氮吹儀伏馬毒素B1、B2標準品，甲醇、乙腈（色譜純），超純水。其它試劑和材料見標準送審稿。檢測實驗過程中采用流動相作為背景溶液，用熒光檢測器對伏馬毒素B1和B2標準液在190～600nm進行掃描（見圖1）。結果表明，伏馬毒素B1和B2最佳激發波長為310nm，最佳發射波長為435nm、430nm。考慮到簡化檢測條件，因此取激發波長為310nm，發射波長為435nm。圖1伏馬毒素B1、B2激發波長掃描譜圖Fig.1FLRExcitationspectrumofFB1andFB2圖2伏馬毒素B1、B2發射波長掃描譜圖Fig.2FLREmissionspectrumofFB1andFB2圖3伏馬毒素B1和B2的色譜圖Fig.3ChromatogramofFB1andFB流動相的優化根據以上條件，參考“GBT25228-2010糧油檢驗玉米及其制品中伏馬毒素含量測定免疫親和柱凈化高效液相色譜法和熒光光度法”的流動相（見色譜條件），流速不同時，峰的保留體積基本相同，表明該流動相對FB1和FB2來說很穩定，結果見表1。表1伏馬毒素的保留體積（按FB2保留體積計算）Table1RetentionvolumeofFB1andFB2流速Flowrate0.15ml/min0.20ml/min0.30ml/min標準偏差STD相對標準偏差RSD（%）保留體積Retentionvolume（mL）1.04331.04381.16270.06886.4當流速為0.2mL/min時，保留時間為5.22min，測1個樣品消耗的甲醇量為：0.2mL/min（流速）×5.22min（保留時間）×0.77（有機溶劑配比）=0.804mL。目前國家標準(GBT25228-2010)測1個樣品至少需16.11×1×0.77=12.405mL,與之相比，本方法的有機溶劑用量是國標方法的1/12，流動相的消耗量少且環保。方法的線性范圍與檢出限在上述色譜條件下，用FB1和FB2的系列標準溶液按選定的色譜條件測定，以UPLC測得的峰面積為縱坐標（y），相應的質量（ng）為橫坐標（x）繪制標準曲線，根據3倍信噪比的峰響應值，得出此方法檢出限，根據10倍信噪比，得出線性范圍的下限，結果見表2。表2FB1和FB2的線性回歸方程及檢出限Table2Regressionequationsanddetectionlimitsofmycotoxins伏馬毒素Fumonisins線性范圍Linearrange(ng)線性方程Linearequation相關系數(R2)檢出限LOD(ng)FB10.25～10.0y=1.7058×105x+1.1600×1040.99720.05FB20.25～10.0y=2.9780×105x+1.6571×1030.99990.05目前現行國家標準GB/T25228-2010[21]給出普通免疫層析凈化HPLC檢測的檢出限為1ng，BILJANAFABRAMOVIC等[22]的研究的玉米中伏馬毒素的高效液相色譜檢測方法，檢出限為0.5（FB1）和1.3ng（FB2）,與之比較，本方法的靈敏度至少提高了10倍。王軍淋等[23]報道的快速高效液相色譜檢測玉米中的伏馬毒素，其檢測限為0.25（FB1）和0.14ng（FB2），也證明了快速高效液相色譜方法的高靈敏度。此外，靈敏度的提高，意味著可以減少用來進樣分析的伏馬毒素的量，在凈化階段可使用柱容量更小的免疫親和柱。傳統HPLC方法，由于靈敏度相對較低，需要柱容量較高的免疫親和柱，要求填充更多的伏馬毒素抗體，增加了分析成本，本方法允許使用容量更低的免疫親和柱，從而也可降低檢測成本。方法檢測限為0.05mg/kg.方法的精密度與回收率將添加FB1和FB2的小麥、玉米樣品按照本方法進行檢測。同一批樣品(FB1為5μg/g,FB2為2.5μg/g)重復測7天，每天測7次，做方法精密度實驗，本方法針對FB1的日內精密度為2.2%，日間精密度為5.5%；FB2的日內精密度為4.3%，日間精密度為7.4%，具有較好的精密度。添加FB1和FB2的稻谷、小麥、玉米樣品，每個濃度做5個平行樣檢測，測方法回收率，結果見表3。從表中可見，表3回收率實驗結果Table3Recoveriesofspikedsampleswithdifferentfumonisinsconcentrations樣品Sample添加量Spikedw(μg/g)平均值Averagevaluew(μg/g)回收率范圍RangrecoveryR/%小麥Wheat（FB1）10.73/1.40/4.1273.0/70.0/82.4小麥Wheat（FB2）0.5/0.38/0.81/1.8776.0/81.0/74.8玉米Corn（FB1）10.75/2.01/4.5275.0/100.5/90.4玉米Corn（FB2）0.5/0.48/0.91/2.1196.0/91.0/84.4綜合來看，本方法的靈敏度比其它高效液相色譜方法高，消耗的有機溶劑少，樣品提取方法、回收率方面與其它高效液相色譜方法相當，具體情況見表.6實際樣品的分析應用建立的方法分析了來自北京地區的40個玉米樣品中的FB1和FB2，結果表明，樣品中通常有一定的本底含量，部分樣品有污染，結果見下表，樣品色譜圖見圖4。從檢測結果看，北京地區的伏馬毒素污染風險不高。表4玉米樣品（FB1+FB2）檢測結果Table4FB1+FB2ofcornsamples含量c（g/kg）未檢出0<c<10001000≤c<20002000≤c<30003000≤c<40004000≤c占比（%）22.550101052.5圖4FB1和FB2污染玉米樣品的色譜圖Fig.4ChromatogramsofFB1andFB2incontaminatedsampleofcorn方法的驗證本方法經北京市糧油食品檢驗所、河南國家糧食質量監測中心、湖南國家糧食質量監測中心、國家糧食局科學研究院檢測中心等4家實驗室驗證。采用玉米谷物進行方法精密度實驗。全部數據采用科克倫和格拉布斯（Grubbs）法檢驗，剔除離群值，根據情況處理歧離值后，計算谷物及其制品中伏馬毒素B1、B2的總體平均值（m），重復性限（r）和再現性限（R），玉米中伏馬毒素B1、B2不同水平采取4家樣品檢測值進行統計，這些結果均符合《食品法典委員會程序手冊》（第二十版）中關于聯合驗證中HorRat在2之內的規定。表5實驗室間聯合驗證統計結果（伏馬毒素B1）參數玉米水平1水平2實驗室數目410參加統計實驗室數目410離群實驗室數目00平均值，m（g/kg）346.1637.3重復性標準偏差，Sr（g/kg）10.815.7重復性限，r（g/kg）30.5244.45再現性標準偏差，SR（g/kg）26.524.6再現性限，R（g/kg）75.169.6HorRat值1.160.64表6實驗室間聯合驗證統計結果（伏馬毒素B2）參數玉米水平1水平2實驗室數目410參加統計實驗室數目410離群實驗室數目00平均值，m（g/kg）613.21498.7重復性標準偏差，Sr（g/kg）11.989.0重復性限，r（g/kg）33.74251.92再現性標準偏差，SR（g/kg）26.1116.8再現性限，R（g/kg）73.9330.6HorRat值0.701.473采用國際標準和國外先進標準的情況，以及與國際、國外同類標準水平的對比，或者與測試的國外樣品、樣機的有關數據對比情況本方法的檢測靈敏度是普通HPLC方法的10倍；消耗有機溶劑少，具有較高的精密度、回收率；檢測時間短，從提取、凈化到色譜分離，整個分析流程耗時不足45min。實際樣品檢測表明，本方法能夠滿足對樣品快速、高通量、低溶劑的檢測要求。表7快速高效液相色譜方法與其他液相色譜方法的性能比較Table7ComparisonoftheUPLCmethodandotherHPLCmethodsreportedrecentlyinliteratureNo.基質Matrix提取凈化Extraction/clear-up流動相/保留時間Mobilephase/retentiontime靈敏度Sensitivity（ng）回收率RecoveryR/%參考文獻Reference1小麥、玉米免疫親和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）0.2mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（77/23,v/v）,6.184minLOD值，FB1、FB2均為0.0570.0～100.52玉米及其制品免疫親和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（77/23,v/v）,16.11minLOD值，FB1、FB2均為176.5～89.3[21]3玉米、玉米飼料免疫親和柱，甲醇/水（4/1，v/v）0.8mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（77/23,v/v）,12.604minLOD值，FB1、FB2均為174.0～85.5[24]4玉米離子交換樹脂萃取，乙腈/水（1/1，v/v）1mL/min，水/三氟乙酸（100/0.025，v/v），乙腈/三氟乙酸（100/0.025，v/v），梯度洗脫,17.22minLOD值，FB1、FB2均為12077.3～102.6[25]5玉米離子交換柱，乙腈-水(1/1,v/v)0.3mL/min，pH值為3.3左右的100mmol/L甲酸銨-甲酸溶液，9minLOQ值，FB1、為0.25、FB2均為0.1475.6～90.0[23]6玉米原料的嬰兒食品免疫親和柱，甲醇/水（4/1，v/v）1ml/min乙腈/水/乙酸(61/38/1v/v/v)LOQ值，FB1、為1、FB2均為0.7579～102[26]7玉米和玉米制品免疫親和柱，甲醇/水（4/1，v/v）1ml/min乙腈/水/乙酸(61/38/1v/v/v),13.34minLOD值，FB1為1、FB2均為0.7579～99.6[27]8玉米強陰離子交換柱，甲醇/水(3:1,v/v)1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（77/23,v/v）,16minLOD值，FB1為1、FB2均為1.2；LOQ值，FB1為2.3、FB2均為2.7-[28]9稻谷離子交換柱，甲醇/水(3:1,v/v)1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（77/23,v/v）,17.6minLOD值，FB1為0.4、FB2均為0.440～80[29]10玉米免疫親和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（78/22,v/v）,14minLOD值，FB1為0.5、FB2均為1.388.7，90.5[22]4與有關的現行法律、法規和強制性國家標準、行業標準的關系本標準頒布實施后，針對糧食中伏馬毒素FB1、FB2的測定，符合現行的法律法規和強制性（國家、行業、地方）標準要求。5重大分歧意見的處理經過和依據無。6按照標準化法的有關規定，提出強制性標準或推薦性標準的建議建議將本標準列為推薦性行業標準。7廢止現行有關標準的建議無8其他應予說明的事項標準采用了快速高效液相色譜儀AcquityUPLC（美國Waters公司），熒光檢測器（FLD，美國Waters公司）和島津公司的快速高效液相色譜儀LC-30A二元高壓梯度系統進行了適應性研究，方法在這兩種儀器上結果符合要求。9參考文獻[1]RheederJP，MarasasWF，VismerHF.ProduetionoffumonisinanalogsbyFusariumspecies.APPlEnvironMicrobiol，2002，68:2101-2105.[2]Jeong-AhS,RobertHP,RonaldDP.CharacterizationoffourclusteredandcoregulatedgenesassociatedwithfumonisinbiosynthesisinFusariumverticillioides[J].FungalGenet.Bio.l,2001,34:155-165.[3]BezuidenhoutSC，GelderblomWCA，Gorst-AllmanCP，etal.Structureelucidationofthefumonisins，mycotoxinsfromFusariommoniliforme.JChemSocChemCommun，1988，743-745.[4]BhatR,RaiRV,KarimAA.Mycotoxinsinfoodandfeed:presentstatusandfutureconcerns.ComprRevFoodSciF,2010,9(1):57-81.[5]EvaluationofCertainMycotoxinsinFood,Fifty-sixthreportoftheJointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives.WorldHealthOrganization:Geneva,2002.1-51.[6]J.M.Soriano,S.Dragacci.Occurrenceoffumonisinsinfoods.FoodResearchInternational37(2004)985–1000.[7]JosepRubert,JoséMiguelSoriano,JordiMa?es,CarlaSoler.Occurrenceoffumonisinsinorganicandconventionalcereal-basedproductscommercializedinFrance,GermanyandSpain.FoodandChemicalToxicology56(2013)387–391.[8]C.M.Lino.L.J.G.Silva.A.L.S.Pena.M.I.Silveira.DeterminationoffumonisinsB1andB2inPortuguesemaizeandmaize-basedsamplesbyHPLCwithfluorescencedetection.AnalBioanalChem,2006,(384):1214–1220.DOI10.1007/s00216-005-0295-z.[9]ShuoWang,YingQuan,NanjuLee,eta.lRapidDeterminationofFumonisinB1inFoodSamplesbyEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayandColloidalGoldImmunoassay[J].AgricFoodChem,2006,54:2491-2495.[10]AlexandraMolinell,iKarinaGrossalber,RudolfKrska.ArapidlateralflowtestforthedeterminationoftotaltypeBfumonisinsinmaize[J].AnalBioanalChem,2009,395(5):1309-1316.[11]權英，詹月華，張根華，秦紅，丁建英，王碩。伏馬毒素B1酶標試紙條檢測方法。食品研究與開發。2011,32（6）：97-100.[12]張玨，朱嵐，陳蘊，周彬，張藝，金堅，黃飚。伏馬毒素B1時間分辨熒光免疫分析超微量檢測方法的建立。環境與健康雜志，2009年，26（12）：1112-1115.[13]EricWSydenham,WentzelCAGelderblom,PieterGThie,letal.EvidenceforthenaturaloccurrenceoffumonisinB1,amycotoxinproducedbyFusariummoniliformeincorn[J].AgricFoodChem,1990,38(1):285-290.[14]LinoCM,SilvaLJG,APena,eta.lOccurrenceoffumonisinsB1andB2inbroa,typicalPortuguesemaizebread[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,118(1):79-82.[15]MarilenaMuscarella,SoniaLoMagro,DonatellaNardiello,etal.DevelopmentofanewanalyticalmethodforthedeterminationoffumonisinsB1andB2infoodproductsbasedonhighperformanceliquidchromatographyandfluorimetricdetectionwithpost-columnderivatization[J].JournalofChromatographyA,2008,1203:88-93.[16]TeresaGazzott,iBarbaraLugobon,iElisaZiron,ieta.lDeterminationoffumonisinB1inbovinemilkbyLC-MS/MS[J].FoodControl,2009,20:1171-1174.[17]JosepRubert,CarlaSoler?,JordiMa?nes.Evaluationofmatrixsolid-phasedispersion(MSPD)extractionformulti-mycotoxindeterminationindifferentfloursusingLC–MS/MS.Talanta85(2011)206–215.[18]SchaafsmaAW,NicolRW,RottinghausG,eta.lAnalysisofFusariumtoxinsinmaizeandwheatusingthinlayerChromatography[J].Mycopathologia,1998,142:107-113.[19]Salisbury,J.J.Journalofchromatographicscience,2008,46:883～886.[20]Mather,J.;Rainville,P.D.;Spooner,N.;Evans,C.A.;Smith,N.W.;Plumb,R.S.Bioanalysis,2011,3:411～420.[21]中華人民共和國國家標準，GB/T25228-2010糧油檢驗玉米及其制品中伏馬毒素含量測定免疫親和柱凈化高效液相色譜法和熒光光度法。[22]BILJANAF.ABRAMOVIC,SANDRAM.JAKSICandZORANS.MASIC.LiquidchromatographicdeterminationoffumonisinsB1andB2incornsamplesafterreusableimmunoaffinitycolumnclean-up.J.Serb.Chem.Soc.,2005,70(6)899–910.[23]王軍淋,胡玲玲,蔡增軒,任一平。超高壓液相色譜法同時檢測玉米中的伏馬毒素B1、B2、B3。食品安全質量檢測學報。2013年，4（1）：215-223.[24]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準，SN/T1572-2005進出口糧谷、飼料中伏馬毒素檢驗方法液相色譜法。[25]JianshengWang,YingZhou,QiaomeiWang.Analysisof