質粒DNA的轉化實驗原理、儀器試劑和操作步驟精品資料質粒DNA的轉化實驗原理、儀器試劑和操作步驟【原理】轉化是將外源DNA分子導入到受體細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉化所用的受體細胞一般是限制 -修飾系統缺陷變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶（ R-，M-）。將對數生長期的細菌（受體細胞）經理化方法處理后，細胞膜、的通透性發生暫時性改變，成為能允許外源 DNA分子進入的感受態細胞。進入受體細胞的 DNA分子通過復制和表達實現信息的轉移，使受體細胞具有了新的遺傳性狀。將經過轉化的細胞在篩選培養基上培養，即可篩選出轉化子（帶有異源 DNA分子的細胞）。本實驗采用CaCl2法制備感受態細胞。其原理是細胞處于0～4℃，CaCl2低滲溶液中，大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經 42℃90秒熱激處理，促進細胞吸收DNA得合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥（ Ampr）得到表達，然后將此細菌培養物涂在含Amp的選擇性培養基上，倒置培養過夜，即可獲得細菌菌落。本實驗是將人Bcl-2重組質粒轉化 DH5α擴增菌，轉化后在含Amp的培養基上進行篩選，生長的菌落即為含重組質粒的工程菌。含人Bcl-2重組質粒的DH5α菌用于質粒DNA的擴增，獲得的質粒將作為限制性內切酶的酶切底物 DNA。【試劑與器材】僅供學習與交流，如有侵權請聯系網站刪除 謝謝2精品資料1．LB液體培養基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高壓滅菌消毒。2．LB固體培養基LB液體培養基中加 1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手背時鋪培養皿。3．0.1mol/LCaCl2高壓滅菌消毒或過濾除菌。4．氨芐青霉素 用無菌水或生理鹽水配制成 100mg/ml溶液，置-20℃保存。5．人Bcl-2重組質粒它是EcoRⅠ單酶切的pBluescriptⅡKS(-)載體與EcoRⅠ單酶切的人Bcl-2cDNA重組而成的，大小為 4861bp，前者是一種由 pUC19質粒衍生而來的具有 2961bp的質粒載體。因此用 EcoRⅠ酶切則應到空載pBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μ。6．大腸桿菌DH5α此為DNA擴增菌．恒溫水浴箱．超凈工作臺．高速冷凍離心機．恒溫搖床．恒溫箱僅供學習與交流，如有侵權請聯系網站刪除 謝謝3精品資料．消毒離心管．消毒tips．玻璃培養皿直徑90mm．玻璃涂布器．95%乙醇．標記筆【操作步驟】．細菌感受態細胞的制備將DH5α菌種劃線于LB瓊脂板上，37℃培養過夜。挑取單菌落接種于 5mlLB培養基中，37℃振蕩培養培養過夜。次日取菌液 1ml接種至含有100mlLB培養基的燒瓶中， 37℃劇烈振蕩培養至約 2～3h，待A600值達到0.3～0.4時將燒瓶置于冰浴 10～15min。將細菌轉移到一個滅菌處理過的冰預冷的50ml離心管中。4000×g，4℃離心10min，棄培養基，將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。加預冷的已過濾除菌的 0.1mol/LCaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4000×g，4℃離心10min，棄培養基。再加 4ml預冷的0.1mol/LCaCl2，輕輕重懸菌體，置 4℃冰箱12～16h。2．DNA重組子的轉化大腸桿菌 DH5α僅供學習與交流，如有侵權請聯系網站刪除 謝謝4精品資料本實驗中的DNA重組子為人Bcl-2重組質粒。在無菌條件下按每管取 200μl新鮮感受態DH5α細菌置于無菌的5ml塑料離心管中，共 2管，分別加入人Bcl-2重組質粒(10ng)和消毒水(作陰性對照)各5μl，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置 30min。42℃，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800μl無抗生素的LB培養基，于37℃空氣搖床中以 150r/min速度振搖45min，使細菌復蘇。每管取 200μl加至含氨芐青霉素（ Amp）的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻，室溫放置 20min，使液體吸收，然后 37℃倒置