1、 食品安全國家標準 食品中雜色曲霉素的測定1 范圍本標準規定了同位素稀釋液相色譜串聯質譜法和高效液相色譜法測定雜色曲霉素的測定方法。本標準用于大米、玉米、小麥、黃豆及花生中雜色曲霉素的測定。第一法 同位素稀釋液相色譜串聯質譜法2 原理試樣中的雜色曲霉素用有機溶劑和水的混合溶液提取，經超聲、渦旋、離心，取上清液用水稀釋，通過固相萃取柱凈化、洗脫、洗脫液經氮氣吹干、甲醇-水溶液定容、微孔濾膜過濾，液相色譜分離，電噴霧離子源離子化，多反應離子監測（MRM）檢測，同位素內標法定量。3 試劑和溶液注：除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。3.1 試劑和標準樣品3.

2、1.1 乙腈：CH3CN，色譜純。3.1.2 甲醇：CH3OH，色譜純。3.2 試劑配制3.2.1 乙腈-水溶液（80/20，V/V）：取800 mL乙腈加入200 mL水。3.2.2 乙腈-水溶液（40/60，V/V）：取400 mL乙腈加入600 mL水。3.2.3 甲醇-水溶液（40/60，V/V）：取400 mL甲醇加入600 mL水。3.2.4 甲醇-水溶液（30/70，V/V）：取300 mL甲醇加入700 mL水。3.3 標準品3.3.1 雜色曲霉素標準品：C18H12O6，CAS編號10048-13-2，純度大于等于99，或帶證書的標準溶液。3.3.2 13C18-雜色曲霉素同

3、位素內標：純度98 %，或帶證書的標準溶液。3.4 標準溶液配制3.4.1 標準儲備溶液（100 g/mL）：準確稱取雜色曲霉素標準品1.0 mg（準確至0.01 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL。此溶液濃度約為100 g/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，密封后-20下保存，備用。3.4.2 標準工作液（1 g/mL）：準確移取100 L的雜色曲霉素標準儲備溶液（10.4.1）至10 mL容量瓶中，用甲醇定容。-20下保存，備用。3.4.3 同位素內標工作液（13C18-雜色曲霉素1 g/mL）：準確移取雜色曲霉素同位素內標（25 g/mL）（3.3.2）0.40 mL至10 mL容量瓶中，用

4、甲醇定容。-20下保存，備用。3.4.4 標準系列工作溶液：準確移取標準工作液（10.4.2）適量至5 mL容量瓶中，加入50 L 1.0 g/mL的同位素內標工作液（3.4.3），用甲醇-水溶液（3.2.4）定容至刻度（含雜色曲霉素濃度為1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL系列標準溶液），此溶液在-20下密封保存。4 儀器和設備4.1 高速粉碎機。4.2 渦旋混合器。4.3 超聲波震蕩器。4.4 天平：感量0.01 g和0.00001 g。4.5 50 mL具塞PVC離心管。4.6 離心機：轉

5、速 6000 r/min。4.7 定量移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0mL。4.8 固相萃取柱：N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料（6 cc，500 mg）柱，或相當者。使用前分別用5 mL甲醇和5 mL水預淋洗并保持柱體濕潤。4.9 帶刻度的磨口玻璃試管：10 mL。4.10 固相萃取裝置。4.11 氮吹儀。4.12 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜。4.13 液相色譜儀：配紫外檢測器。4.14 液相色譜柱：C18柱（柱長100 mm，柱內徑2.1 mm，填料粒徑1.8 m），或相當者。4.15 試驗篩：1-2mm孔徑。5 分析步驟5.1 樣品制備試樣的采樣量需大于1

6、kg，用高速粉碎機（5.1）將其粉碎（1-2mm孔徑試驗篩），混合均勻后取樣品100 g用于檢測。5.2 樣品提取在50 mL離心管（4.5）中稱取5 g均質試樣（精確至0.01g），加入100 L 同位素內標工作液（3.4.3），加入20.0 mL乙腈-水（3.2.1），置于超聲波震蕩器中震蕩10分鐘，渦旋混勻15分鐘，在6000 r/min 下離心10分鐘，準備移取2.0 mL上清液用水稀釋至8 mL待上樣。5.3 凈化將上樣液轉移至活化好的固相萃取柱中，控制樣液以2-3 mL/min的速度穩定下滴。上樣完畢后，依次加入5 mL 的乙腈-水溶液（3.2.2）、5 mL的甲醇-水溶液（3.2

7、.3）淋洗。擠干固相萃取柱，加入6 mL乙腈洗脫，控制流速為23 mL/min，擠干，收集洗脫液。在60 下用氮氣緩緩吹至干，用甲醇-水溶液（3.2.4）定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 m濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。5.4 儀器參考條件5.4.1 色譜參考條件流動相：A相：水，B相：甲醇。梯度洗脫條件：70 % B（05 min），100 % B（58 min），70 % B（812 min）。流速：0.2 mL/min。色譜柱柱溫：40 。進樣量：10 L。5.4.2 質譜參考條件檢測方式：多離子反應監測（MRM）。離子源控制條件：參見附錄A.1中的表A.1-

8、1。離子選擇參數參見附錄A.1中的表A.1-2。子離子掃描圖參見附錄A.2中的圖A.2-1至圖A.2-2。液相色譜-質譜圖見附錄A.2中的圖A.2-3。5.5 定性試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在2.5 之內。待測化合物的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于3（S/N 3），定量離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于10（S/N 10）。每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表1規定的范圍。表1 定性

9、時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度 50 % 20 %至50 % 10 %至20 % 10 %允許相對偏差 20 % 25 % 30 % 50 %5.6 空白試驗不稱取試樣，按5.2、5.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。6 結果計算6.1 標準曲線繪制將標準工作系列溶液（3.4.4）由低到高濃度進樣檢測，以雜色曲霉素色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。6.2 定量測定待測樣液中的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后重新按5.2、5.3進行處理后再進樣分析。6.3 計算按式（1）計算雜色曲霉素的殘留量。X=AvfM式中：X試樣

10、中雜色曲霉素的含量，單位為微克每千克，gkg-1；A根據試樣中雜色曲霉素的色譜峰與對應內標色譜峰的峰面積關系，經計算所得的濃度，單位為納克每毫升，ngmL-1；v最終定容體積，單位毫升，mL；M試樣的稱樣量，單位克，g；f稀釋倍數（k=0.1）；計算結果保留三位有效數字。7 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %8. 其他稱取大米、玉米、小麥、黃豆及花生5 g，其檢出限為0.6 g/kg，定量限為2 g/kg。第二法 液相色譜法9 原理樣品中的雜色曲霉素水和有機溶劑的混合溶液提取，經均質、渦旋、超聲、離心等處理，取上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋，經免疫親和

11、柱凈化、洗脫，洗脫液經氮氣吹干、流動相定容、微孔濾膜過濾，液相色譜分離紫外檢測器檢測。外標法定量。10 試劑和溶液注：除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。10.1 試劑和標準樣品10.1.1 乙腈：CH3CN，色譜純。10.1.2 甲醇：CH3OH，色譜純。10.1.3 氯化鈉：NaCl， 10.1.4 磷酸氫二鈉：Na2HPO4， 10.1.5 磷酸二氫鉀：KH2PO4，10.1.6 濃鹽酸：HCl10.1.7 氯化鉀：KCl10.2 試劑配制10.2.1 乙腈-水溶液（80/20，V/V）：取800 mL乙腈加入200 mL水。10.2.2 乙腈-

12、水溶液（50/50，V/V）：取500 mL乙腈加入500 mL水。10.2.3 磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱PBS）：稱取8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉），0.2 g磷酸二氫鉀，0.2 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用濃鹽酸調節pH值至7.4，用水定容至1000 mL。10.3 標準品 雜色曲霉素標準品：C18H12O6，CAS編號10048-13-2，純度大于等于99，或帶證書的標準溶液。10.4 標準溶液配制10.4.1 標準儲備溶液（100 g/mL）：準確稱取雜色曲霉素標準品1.0 mg（準確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL。此溶

13、液濃度約為100 g/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，密封后-20下保存，備用。10.4.2 標準工作液（1 g/mL）：準確移取100 L的雜色曲霉素標準儲備溶液（10.4.1）至10 mL容量瓶中，用乙腈定容。-20下保存，三個月內有效。10.4.3 標準系列工作溶液：準確移取標準工作液（10.4.2）適量至5 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液（10.2.2）定容至刻度（含雜色曲霉素濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL系列標準溶液），此溶液在-20下密封保存。11 儀器和設備11.1 高速粉碎機。11.2 渦旋混合器。11

14、.3 超聲波震蕩器。11.4 天平：感量0.01 g和0.00001 g。11.5 50 mL具塞PVC離心管。11.6 離心機：轉速 6000 r/min。11.7 定量移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0mL。11.8 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。11.9 免疫親和柱：柱容量 100 ng。（柱容量驗證方法參見附錄B.2）11.10 帶刻度的磨口玻璃試管：10 mL。11.11 固相萃取裝置。11.12 氮吹儀。11.13 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜。11.14 液相色譜儀：配紫外檢測器。11.15 液相色譜柱：C18柱（柱長150 mm，柱內徑4.6

15、mm，填料粒徑3.5 m），或相當者。11.16 試驗篩：1-2mm孔徑。12 分析步驟使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品的上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應該按照供應商所提供的操作說明書要求進行操作。12.1 樣品制備樣品采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機（11.1）將其粉碎（1-2mm孔徑試驗篩），混合均勻后取樣品100 g用于檢測。12.2 樣品提取在50 mL離心管（11.5）中稱取5 g已均質試樣（精確至0.01g），加入20.0 mL乙腈-水（10.2.1），置于超聲波震蕩器中震蕩10分鐘，渦旋混勻15分鐘，在6000 r/min 下離心10分鐘，取上清液備用。12.3 樣品

16、凈化12.3.1 上樣液的準備準確移取2 mL上述上清液，加入28 mL PBS（10.2.3）混勻。12.3.2 免疫親和柱的準備將50 mL注射器筒（11.8）與親和柱（11.9）的頂部相連。12.3.3 試樣的凈化免疫親和柱內的液體放棄后，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，調節下滴速度，控制樣液以2-3 mL/min的速度穩定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內依次加入10 mL PBS和10 mL水，以穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，擠干親和柱。在親和柱下部放置10 mL刻度試管，取下50 mL的注射器筒，加入2 mL乙腈洗脫親和柱，控制2-3 mL/min的自然下滴速度，收集全部洗

17、脫液至刻度試管中，繼續擠干親和柱。在60 下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至干，用乙腈-水（10.2.2）定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 m濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。12.4 儀器參考條件色譜參考條件流動相：A相：水，B相：乙腈。梯度洗脫條件：60 % B（06 min），100 % B（69 min），60 % B（915 min）。流速：0.8 mL/min。色譜柱柱溫：40 。進樣量： 100 L。紫外檢測器：檢測波長：325 nm。液相色譜圖參見附錄B中的圖B-1。12.5 測定12.5.1 標準曲線的制作 將標準系列溶液（10.4.3）由低到高濃度依次進樣檢

18、測，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線回歸方程。12.5.2 定量測定待測樣液中待測化合物的響應值應在標準曲線線性范圍內，濃度超過線性范圍的樣品則應稀釋后重新按12.2和12.3進行處理后再進樣分析。12.5.3 空白試驗不稱取試樣，按12.2和12.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。13 計算結果按式（2）計算雜色曲霉素的殘留量。X=Avf式中：X試樣中雜色曲霉素的含量，單位為微克每千克，gkg-1；A根據試樣中雜色曲霉素的色譜峰面積，經計算所得的濃度，單位為納克每毫升，ngmL-1；v最終定容體積，單位毫升，mL；M試樣的稱樣量，單位克，g；f稀釋倍數（k=0.1）；計算結果保留三位有效數字。14 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。15