1、基于硝酸纖維素膜和手機拍照檢測與傳輸的快速低成本尿液檢測紙芯片的研制學 生 曹雪指導教師 周小棉 李難廣州市第一人民醫院檢驗科 2011年3月2日技術路線選題依據研究目標 研究內容擬解決的關鍵問題可行性分析預期結果進度安排實驗方法參考文獻微流控芯片又稱芯片實驗室（Lab on a Chip），指的是把生物和化學等領域中所涉及到的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上,由微通道形成網絡,以可控流體貫穿整個系統,用以實現常規生物或化學實驗室的各種功能的一種技術。石英玻璃硅PMMAPDMS常見微流控芯片的材料紙材料的一些特殊的優點：1）成本低廉 適

2、合制備一次性使用的芯片；2）無需外界動力源 組成紙的纖維素可以吸收水分，表面張力可以作為整個芯片的驅動力；3）紙具有可燃性 紙質芯片在完成分析功能后可以采取燃燒的方法安全處理，不會留下生物垃圾。 2007年初哈佛大學的Whitesides小組首次嘗試將紙作為一種微流控芯片的制作材料。 紙質微流控芯片的研究目前正處于初步發展階段。光刻法噴墨打印法等離子處理法繪圖法芯片制作方法1）Whitesides 小組提出利用拍照手機對紙芯片上的生化反應的顯色結果進行拍照并進行遠程傳輸，實現現場檢測、遠程診斷。2）Dungchai等人在紙芯片上集成電極，在紙芯片上實現了葡萄糖、乳酸和尿酸的電化學同時檢測。3）

3、Delaney等人在紙芯片上集成了電化學發光檢測。 芯片檢測技術 硝酸纖維素膜1.蛋白吸附能力強；2.孔徑僅為0.45m3.表面更為光滑和均勻現場即時診斷（Point of care testing，POCT）又稱為床邊檢測或病人身邊檢測、家用檢驗等。同時具有：空間上的“現場”和時間上的“即時”。現場即時診斷具有廣闊的應用領域，要求分析速度快、操作簡便、體積小、便攜化等。現場即時診斷常用的技術包括干化學法測定、 免疫層析和生物傳感器等，現在正在發展中的一些現場即時診斷技術還包括微流控芯片、生物芯片、圖形分析、納米技術和表面等離子共振技術等。尿液常規分析是臨床上最重要的三大常規檢測項目之一，主要

4、用于泌尿生殖系統疾病、代謝性疾病（如糖尿病等）、肝膽疾病及其他系統疾病的診斷和鑒別診斷、治療檢測及健康普查。干化學尿液分析儀BACK通過應用硝酸纖維素膜作為紙芯片的制作材料，研制出可用于尿液蛋白質、葡萄糖、白細胞、潛血（紅細胞/Hb)、亞硝酸鹽、pH、比重、酮體、膽紅素、尿膽原、維生素C等11項檢測的一次性紙芯片，并且利用拍照手機作為檢測器，將拍得的圖像傳輸到電腦上，再用軟件對其取值進行定量分析或肉眼觀察進行定性分析。期望可為邊遠山區、野外、急救現場等遠離中心醫院的患者提供新一代價格低廉的即時遠程檢驗工具。研究目標 BACK研究內容1.紙芯片的制備用噴蠟打印技術制備各種被檢項目的試劑儲存區、樣

5、本分配通道和加樣區；針對不同的檢測項目將其試劑加入試劑貯存區，經烘干形成紙芯片。利用拍照手機作為檢測器，并用軟件（如Imagepro、Photoshop）對其取值進行定量分析，研究紙芯片各項檢測指標的檢測靈敏度、線性范圍、批間變異與批內變異以及儲存有效期；2.紙芯片的性能檢測3.比對紙芯片的尿液分析結果與現有的尿11項分析儀的結果進行比對（尿蛋白質、葡萄糖、白細胞、潛血（紅細胞）、亞硝酸鹽、pH、比重、酮體、膽紅素、尿膽原、維生素C等11項檢測）BACK技術路線芯片的設計噴蠟打印與烘烤試劑加載手機拍照與定量分析紙芯片性能考察與常規分析法進行比對BACK紙芯片的制備 1.尿十一項檢測用紙芯片初步

6、設計圖：黑色中心圓區為樣品加載區；周邊各黑色中心圓區為試劑儲存區（反應區或測試區）；其中左上角質控是指顯色劑質控；放線狀線條為進樣通道（等長度）。實驗方法2.噴蠟打印制備硝酸纖維素膜紙芯片噴蠟打印：首先在電腦上利用繪圖軟件如Freehand 等設計各種圖案，然后用噴蠟打印機在硝酸纖維素膜（Whatman (BA 85, 0.45 m pore size)）上打印出所設計的圖案。烘烤：將噴蠟打印的硝酸纖維素膜置入125 烘箱中烘烤5 min，讓打印的蠟熔化并透過膜形成封閉的疏水圍堰。 3.紙芯片檢測區試劑的加載與檢測原理 具體內容測定項目試劑儲存區所要加載的試劑加載試劑的量檢測原理葡萄糖碘化鉀溶

7、液（0.6M）和辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶的溶液各0.5L葡萄糖會在葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的催化反應下與碘化鉀反應產生黃色產物。 尿酸顯色劑，辣根過氧化物酶和lactate oxidase (114UmL1)溶液各0.5L尿酸會在尿酸氧化酶與辣根過氧化物酶的催化反應下于顯色劑反應產生有色產物。 白細胞吲哚酚酯1L利用粒細胞酯酶能水解吲哚酚酯，生成吲哚酚與有機酸，吲哚酚進一步氧化生成靛藍。 隱血（紅細胞 Hb）顯色劑，過氧化氫溶液各0.5L血紅蛋白具有類過氧化物酶作用，以催化過氧化氫作為電子受體使色原氧化呈色。亞硝酸鹽Gries試劑1L大腸埃希菌等革蘭陰性桿菌能還原尿液中的硝酸鹽為亞硝酸

8、鹽。后者使試劑中的對氨基苯磺酸重氮化，成為對重氮苯磺酸再與-萘胺結合成N-萘胺偶氮苯磺酸，呈現紅色。 PH溴麝香草酚藍1L溴麝香草酚藍在酸性為黃色，中性為綠色，堿性為藍色。 比重酸堿指示試劑1L尿中電解質釋放出陽離子，陽離子與離子交換體中的氫離子交換，使之釋放出氫離子，氫離子再與其中的酸堿指示劑反應，根據指示劑顯示的顏色可推知尿中的電解質濃度，以電解質濃度來代表密度，從而得出比重值。酮體酮體試劑（亞硝基鐵氰化鈉、無水碳酸鈉和硫酸銨按比例組成）1L含酮體的尿液中加入亞硝基鐵氰化鈉后，與氨液接觸時出現紫色。 膽紅素二氯苯胺重氮鹽1L在強酸性介質中，膽紅素與二氯苯胺重氮鹽起偶聯作用，生成紅色偶氮化合

9、物。 尿膽原二甲基氨基苯甲醛1L尿膽原在酸性溶液中與對二甲基氨基苯甲醛反應，生成紅色化合物。 維生素C磷鉬酸1L維生素C與磷鉬酸反應，生成鉬藍。 二. 定量分析用拍照手機對顯色分析區域進行拍照 將照片通過USB 數據線、紅外或互聯網遠程傳輸等方法將其傳輸到電腦中 利用電腦中圖像分析軟件對反應區域圖像信號轉換成8 位灰度模式，然后選取分析區域獲得分析區域的平均灰度值，實現結果量化 對得到的數值進行結果判定 三. 紙芯片性能考察用標準品、尿液樣本對尿液11項分析紙芯片的各項指標進行檢測靈敏度、線性范圍、批間變異與批內變異以及儲存有效期等性能考察.BACK四. 比對取一定數目的尿液標本，同時用紙芯片

10、與常規分析法（全自動尿11項分析儀法）進行檢測，再將兩個結果進行線性相關分析。1.紙芯片的設計（整個芯片的大小、具體每個區域的大小尺寸和相對比例等），各個反應區會不會相互影響。2.試劑加載。3.如何具體地對制作出來的尿液檢測紙芯片進行相關的性能考察。4.試劑反應區的成像問題。 擬解決的關鍵問題BACK可行性分析儀器與器材 試劑研制了一種手機微距拍攝增強裝置較好地解決普通手機高清淅成像問題硝酸纖維素膜的選擇 噴蠟打印條件的選擇時間優化和溫度優化初步建立了以蠟制備的紙芯片用于BSA 與葡萄糖的生化分析 BACK預期結果理想不理想各個反應區的顯色深淺與尿液中各個成分的濃度呈一定的相關性。且可以用手機

11、拍攝高清晰的圖像，并在電腦上進行定量分析。BACK1月2月：查閱相關文獻,立題,作開題報告。 3月4月：制作紙芯片，對其性能進行檢測，與常規的分析方法進行比對。5月：整理分析相關數據，討論結果，論文寫作與修改。進度安排BACK參考文獻1、周小棉，林炳承。 廣東醫學，2004， 25(3):124-126。2、Science 14 October 2005: Vol. 310. p. 1993、Daw R, Finkelstein J. Nature, 2006, 442(7101):367-418.4、Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J.

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