1、RNA干擾抑制CD147表達對人胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響2010.5.18王書奎 MD, PhD 南京醫科大學附屬南京第一醫院報告內容 研究背景 研究目標 實驗方法與結果 實驗結論一、 研究背景胃癌概況 胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位 。其惡性程度較高，轉移擴散嚴重，多數患者就診時已屬中晚期，因而死亡率較高 。MMP簡介 腫瘤的侵襲和轉移是一個復雜的過程，其中細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤轉移過程中的重要步驟。這與細胞外基質金屬蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的參與密不可分。 MMP是一個鋅

2、離子依賴的蛋白酶家族，目前已發現26種。MMP的主要功能是降解細胞外基質。腫瘤細胞利用MMP的基質降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質交界處，MMP往往高表達 。 20世紀80年代，Biswas實驗室從人肺癌細胞株LX-1的細胞膜上分離得到了一種58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。 進一步研究表明TCSF不僅能刺激MMP-1的產生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產生，因此將其重命名為細胞外基質金屬酶誘導因子（extracel

3、lular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。 第六屆人類白細胞分化抗原協作組會議將EMMPRIN命名為CD147。CD147的結構 CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個半胱氨酸殘基形成2個二硫鍵，構成2個典型的半球形Ig結構域。 細胞內的CD147存在低糖基化（ low glycosylated CD147， LG）和高糖基化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分別是3244kDa、4565kDa。只有HG形式能刺激MMP的產生。CD147的功能 CD147是一種廣泛表達于細胞表面，在體內分布廣泛，參與精

4、子發生、胚胎發育、腫瘤的侵襲和轉移、炎癥反應、病毒感染等多種生理和病理過程，是一個多功能的分子。 免疫組化實驗證實CD147在多種惡性腫瘤中高表達，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達水平也越高。CD147在腫瘤發生發展中的作用 1. 促進腫瘤的侵襲和轉移 CD147就是通過刺激成纖維細胞及腫瘤細胞本身產生多種MMP來降解基底膜和細胞外基質，從而促進腫瘤的浸潤和轉移的。 2. 誘導腫瘤血管生成 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）是很多情況下血管生成過程的主要調節因子，包括

5、腫瘤形成過程 。CD147可以誘導VEGF的表達。 3. 促進腫瘤細胞多藥耐藥 在多種多藥耐藥的腫瘤細胞中都觀察到CD147的高表達。CD147可激活PI3K/AKT細胞存活信號通路。在大多數惡性腫瘤細胞中此通路均被激活。胃癌中CD147的表達 日本Toyama大學的Zheng HC等研究表明：在正常胃黏膜發展為增生性或化生性胃黏膜，最后發展為胃癌的過程中，CD147的表達量是逐漸增加的，并且CD147的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達呈正相關。 胃癌組織中CD147的表達CD147在胃癌組織中高表達二. 研究目標 本實驗旨在運用RNA干擾技術抑制

6、胃癌細胞株SGC7901中CD147基因的表達，研究該基因沉默后對腫瘤細胞生長、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。三、研究方法及結果CD147shRNA真核表達載體的構建與鑒定轉染SGC7901細胞，篩選穩定表達干擾載體的SGC7901細胞株MTT法檢測SGC7901細胞增殖水平的變化明膠酶譜法檢測SGC7901細胞MMP-2、MMP-9分泌的變化SGC7901細胞體外侵襲力測定MTT檢測SGC7901細胞順鉑敏感性的變化技術路線技 術 路 線 胃癌細胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結轉移瘤。研究表明其侵襲能力強，惡性程度高。我們前期研究表明，該

7、細胞表面CD147是高表達的。 shRNA（short hairpin RNA）表達載體的構建pSilencer3.1-H1 neoshRNA模板的設計示意圖干擾靶序列的選擇 參考陳翔等的報道，選取CD147mRNA 370-390和808-828作為靶序列，相應的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另外，設計一個陰性對照shRNA-control。RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GG

8、GCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCA

9、GC TCCACGGGCC351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTG

10、CAACGGC601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG

11、 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT設計好的shRNA插入序列shRNA15-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-35-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3s

12、hRNA2 5GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3 5AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3shRNA-control5GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3 5AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-32、CD147 shRNA

13、表達載體的構建： 將合成的三對片段分別用水浴中加熱后退火備用，與經BamH I和Hind III雙酶切的pSilencer3.1-neo質粒連接，構建成CD147 shRNA表達載體，重組質粒分別命名為pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。重組質粒測序鑒定結果DNA測序表明，3個重組質粒構建正確。pSilencer/shRNA1測序圖（紅線為插入片段）轉染及篩選 脂質體轉染48h后用含0.4g/ml的G418的完全培養基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽性細胞克隆用有限稀釋法分離出來并逐步擴增以待進一

14、步分析。篩選出的細胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。Real-time PCR檢測CD147 mRNA表達水平 與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細胞中CD147 mRNA相對表達量分別下降至72.4%和17.3% 。 1 2 3 4HGLGCD147-actinLane 1: SGC7901.Lane 2: SGC7901/shRNA-controlLane 3: SGC7901/shRNA1Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的C

15、D147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot結果與Real-time PCR結果相符。接種細胞 培養細胞 加入MTT呈色 終止培養 比色 結果計算 抑制率(%)=(對照組A 值-實驗組A 值)對照組A 值100% 24h、48h、72h 時間點MTT細胞增殖實驗 與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細胞增殖能力均顯著降低.而陰性對照組SGC7901/shRNA-control增殖能力無顯著改變。明膠酶譜法檢測細胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明膠酶包括72 kDa的明膠酶A（基質

16、金屬蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明膠酶B (基質金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物為基底膜中的型膠原和變性的間質膠原（明膠），其活性與腫瘤細胞侵襲和轉移能力密切相關。 明膠酶譜法是一種測定明膠酶活性的常用方法。收集細胞培養上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開，顯示兩條負染條帶，根據條帶的面積和亮度可判定明膠酶的活性。明膠酶譜結果MMP-2MMP-9 1 2 3Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control.Lane 3:SGC7901/shRNA2*BSGC7901/shRNA2細胞上清液中MMP-2

17、和MMP-9的活性明顯降低 Transwell原理 Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有層粘連蛋白、型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結構。Transwell結果穿過Transfer侵襲小室的染成紫色的細胞（400）SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2SGC7901/shRNA2細胞 體外侵襲能力顯著降低B*順鉑敏感性實驗 抗腫瘤藥物順鉑的使用濃度以血漿峰濃度（ Peak Plasma Concentration，PPC) 為標準。參照Sondak等的報道

18、，順鉑的PPC為3.0 g/ml。 本實驗中使用的順鉑濃度為：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。細胞生長抑制率（%）=1-OD(cisplatin）/OD(cisplatin) 100% 與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，順鉑對SGC7901/shRNA2的抑制率顯著增加*四、實驗結論成功構建了靶向CD147的shRNA真核表達載體；成功轉染了人胃癌細胞SGC7901，并獲得了穩轉細胞株，經Real-time PCR、Western Blot檢測，CD147在mRNA和蛋白水平均被顯著抑制；CD147表達沉默后SGC7901的增殖能力明顯降低，細胞的MM

19、P-2和MMP-9的活性明顯降低，細胞的體外侵襲能力明顯降低，細胞對化療藥物順鉑的敏感性增強。 我們的研究表明：CD147在胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和化療藥物敏感性中發揮重要作用；CD147可能是胃癌治療的一個有效的靶點。 下一步的研究方向1.動物水平的實驗（裸鼠移植瘤模型，體內腫瘤細胞侵襲實驗）；2.CD147自身的表達調控；3.CD147在其他消化系統腫瘤中的作用；4.CD147多藥耐藥的機制。Thanks for your attention!凍傷的護理診斷（男，14歲）雙足凍傷5%，III1%主述雙足低溫凍傷10天現病史患者于入院10天前，在雪地里走，鞋浸濕后，致雙足凍傷。傷后

20、自行用溫水復溫。自覺局部腫脹不適，行走受限，在當地的醫院治療，具體不詳。因雙足皮膚破潰，肢端發黑，來我院治療。專科情況雙足紅腫，表皮的溫度較正常的皮膚高，表皮部分剝脫。創面的基底紅潤，或紅白相間。痛覺敏感或遲鈍。有炎性滲出，無明顯異味，末梢循環差，右足趾端皮膚部分發黑。白細胞:12.2*109/L,中性粒細胞：7.79*109/L冷傷的概念冷傷是低溫一起的人體組織細胞的損傷冷傷的分類非凍結性凍傷:10度以下至冰點以上的低溫加以潮濕條件所造成的損傷.凍結性損傷:冰點以下的低溫造成組織細胞冷凍所致的損傷.局部凍結性冷傷-凍傷按損傷范圍分全身性冷傷局部性冷傷凍僵，凍亡，凍傷，凍瘡，戰壕足，浸泡足(手

21、)按損傷性質分凍結性冷傷非凍結性冷傷凍瘡，戰壕足，浸泡足(手)凍僵，凍亡，凍傷病因和發病機制由于寒冷刺激，局部皮膚小動脈痙攣并造成組織缺氧、缺血和細胞損傷；如持續時間較長，細胞內外環境改變，可出現血管麻痹性擴張，靜脈瘀血，其通透性增加，血漿滲入組織間隙而引起水腫。濕冷環境(特別是氣溫在10以下)、末梢血運微循環異常，自主神經功能紊亂、營養不良性貧血和手部多汗均可促使凍傷的發生。 凍傷分四度 一度:凍傷最輕，亦即常見的“凍瘡”，受損在表皮層，受凍部位皮膚紅腫充血，自覺熱、癢、灼痛，癥狀在數日后消失，愈后除有表皮脫落外，不留瘢痕。二度:凍傷傷及真皮淺層，傷后除紅腫外，伴有水泡，泡內可為血性液，深部

22、可出現水腫，劇痛，皮膚感覺遲鈍。凍傷分四度 三度:凍傷傷及皮膚全層，出現黑色或紫褐色，痛感覺喪失。傷后不易愈合，除遺有瘢痕外，可有長期感覺過敏或疼痛。四度:凍傷傷及皮膚、皮下組織、肌肉甚至骨頭，可出現壞死，感覺喪失，愈后可有疤痕形成。凍傷緊急處理辦法1、迅速脫離寒冷環境盡快復溫。2、那么如何復溫呢?迅速脫掉凍傷者寒冷潮濕的衣褲襪,盡快使局部或全身浸泡在4042度的水中，3、局部用水或者肥皂水清潔后用凍傷膏。2度以上凍傷，需敷料包扎好。皮膚較大面積凍傷或壞死時，注射破傷風抗毒素或類毒素。 凍傷緊急處理辦法4、在野外無溫水的條件下，也可把傷者放在未凍傷人的腋下或腹股溝等地方復溫。注意，嚴禁火烤，雪搓，冷水浸泡或猛力捶打傷者患部 5、對局部凍傷的急救要領是一點一點地、慢慢地用與體溫一樣的溫水浸泡患部使之升溫。如果僅僅是手凍傷，可以把手放在自己的腋下升溫。然后用干凈紗布包裹患部，并去醫院治療。 凍傷治療1、凍傷的肢體應迅速在溫水中使之溫暖或靜脈點滴熱液體復溫（38-40度）。2、復溫后繼續采取保暖措施,保護受傷部位,預防外傷.3、防