1、浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案及報(bào)告 TOC o 1-5 h z 驗(yàn)證方案申請(qǐng)人：日期：年月日驗(yàn)證方案審核人：日期：年月日驗(yàn)證方案審批人：日期：年月日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司1概述無(wú)菌檢查法是為了檢查藥典要求無(wú)菌的醫(yī)療器械產(chǎn)品是否無(wú)菌而建立的檢查法，是作為批準(zhǔn)無(wú)菌產(chǎn)品放行的檢驗(yàn)或監(jiān)督部門對(duì)無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督中的一個(gè)重要項(xiàng)目。它是根據(jù)用于實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中是否有微生物生長(zhǎng)來(lái)判定樣品的無(wú)菌性，液體培養(yǎng)基變渾濁一般表明樣品受微生物的污染。基于微生物污染的不均勻性，使無(wú)菌檢查法結(jié)果的可信度受許多因素制 約，如抑菌因素、檢查法、檢驗(yàn)量、檢查用的培養(yǎng)基質(zhì)量、操作環(huán)境、無(wú)菌技術(shù)等。檢驗(yàn) 方法的驗(yàn)證是

2、現(xiàn)代質(zhì)量保證體系中關(guān)系到質(zhì)控技術(shù)、方法、手段的科學(xué)性、準(zhǔn)確性的重要組成部分，是保證檢驗(yàn)結(jié)果的公正、科學(xué)、準(zhǔn)確的基礎(chǔ) 。2驗(yàn)證目的對(duì)本公司所采用的直接接種無(wú)菌檢查法進(jìn)行分析驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于本 公司產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。3實(shí)驗(yàn)原理直接接種法是通過(guò)加入一定的抑菌中和劑，以方便而快捷地中和抑菌劑，消除抑菌作 用，從而消除抑菌作用對(duì)無(wú)菌檢查的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)對(duì)直接接種法所加入的抑菌劑的中和效果進(jìn)行驗(yàn)證，從而得 出直接接種法無(wú)菌檢驗(yàn)的有效性。4驗(yàn)證范圍實(shí)用于本公司所采用的直接接種法進(jìn)行的無(wú)菌檢驗(yàn)過(guò)程驗(yàn)證。5執(zhí)行程序文件編碼文件名稱存放部門HY-QC-012尢菌檢驗(yàn)操作規(guī)程品管部6職責(zé)姓

3、名職務(wù)職責(zé)劉傳杰經(jīng)理負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的批準(zhǔn)實(shí)施、驗(yàn)證報(bào)告的批準(zhǔn)周德標(biāo)QC驗(yàn)證方案、驗(yàn)證報(bào)告的起草并負(fù)責(zé)驗(yàn)證過(guò)程中現(xiàn)場(chǎng)的監(jiān)控及取樣張思東QC負(fù)責(zé)按制訂無(wú)菌檢驗(yàn)規(guī)程實(shí)施檢驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)7驗(yàn)證內(nèi)容建立樣品組、對(duì)照組及菌種活性檢查組，接種菌株到指定培養(yǎng)基，培養(yǎng)2472小時(shí)，比較觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，得出結(jié)論。8驗(yàn)證指示物本實(shí)驗(yàn)所用菌種為購(gòu)于 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究所標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、白色念球菌、大腸埃希菌及生胞梭菌。浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司9實(shí)驗(yàn)過(guò)程(1)培養(yǎng)基的配制用于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于白色念球菌的改良馬丁培養(yǎng)基用于生抱梭菌的流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(2)供試品的制備創(chuàng)可貼供

4、試品：將包裝好的創(chuàng)可貼打開，用剪刀將創(chuàng)可貼剪碎，放入100ml pH7.0氯化鈉一蛋白月東緩沖液中浸泡1小時(shí)，取水層作為供試品。無(wú)菌敷貼供試品：將包裝好的無(wú)菌敷貼打開，用剪刀將無(wú)菌敷貼剪碎，放入100mlpH7.0氯化鈉一蛋白月東緩沖液中浸泡1小時(shí)，取水層作為供試品。(3)供試菌液的制備大腸埃希菌菌液：取經(jīng) 35c培養(yǎng)19小時(shí)的大腸埃希菌培養(yǎng)物 1ml,加9ml生理鹽水， 10倍稀釋至約10-510-8之間，混勻備用。金黃色葡萄球菌菌液：取經(jīng)35c培養(yǎng)19h小時(shí)的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物1ml,加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約0-510-8之間，混勻備用。白色念球菌菌液：取經(jīng) 25.5C培養(yǎng)72小

5、時(shí)的白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽 水4ml洗下抱子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，取 1ml力口 9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6, 取1.2ml加生理鹽水9ml,混勻備用。生抱梭菌菌液：取經(jīng) 35 c培養(yǎng)18h的生抱梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml,加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6,混勻備用。(3)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)樣品組：按照本公司常規(guī)微生物檢驗(yàn)方法進(jìn)行，加入抑菌中和劑，最后接入已知 量的菌株(& 100cfu),培養(yǎng)觀察。陽(yáng)性對(duì)照組：以0.1%的蛋白月東代替供試品，加入抑菌中和劑，最后接入同樣量的菌株， 培養(yǎng)觀察。陰性對(duì)照組：取與實(shí)驗(yàn)樣品組等量的供試品，加入與中和劑等量的生理

6、鹽水，最后接 入已知量的菌株(w 100cfu),培養(yǎng)觀察菌種活性檢查組：直接將菌種接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察。10標(biāo)準(zhǔn)與判斷.如果實(shí)驗(yàn)樣品組與陽(yáng)性對(duì)照組的微生物計(jì)數(shù)相似，表明所用中和劑(中和劑類別及用 量)具有足夠的中和效力；.如果陽(yáng)性對(duì)照組與菌種活性檢查組的微生物生長(zhǎng)數(shù)量相似，表明所用的中和劑不影響微生物的生長(zhǎng)。.陰性對(duì)照組微生物生長(zhǎng)量應(yīng)低于實(shí)驗(yàn)組，才能證明供試劑有抑菌性，否則該實(shí)驗(yàn)無(wú)意 義。.樣品組的平均菌檢計(jì)數(shù)結(jié)果不得低于對(duì)照組的70%,否則直接否定無(wú)菌檢驗(yàn)方法。浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司11檢驗(yàn)與記錄無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿）NO:供試品：實(shí)驗(yàn)時(shí)間:試驗(yàn)組名檢驗(yàn)菌而一-實(shí)驗(yàn)樣品

7、組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球 菌12345平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人:日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司12編寫驗(yàn)證報(bào)告(1)根據(jù)驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；(2)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)編寫驗(yàn)證報(bào)告。13再驗(yàn)證周期及日常監(jiān)測(cè)(1)無(wú)菌檢查按所生產(chǎn)的每批次進(jìn)行日常監(jiān)測(cè)；(2)當(dāng)無(wú)菌檢查日常監(jiān)測(cè)出現(xiàn)不符合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，必須進(jìn)行再驗(yàn)證；(3)當(dāng)無(wú)菌檢查方法發(fā)生改變和生產(chǎn)工藝發(fā)生改變時(shí)，必須重新驗(yàn)證；(4)本驗(yàn)證方案有效期為 1年。14驗(yàn)證結(jié)果與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)人對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果做好相關(guān)記錄并進(jìn)行科學(xué)性評(píng)價(jià)；15驗(yàn)證方案的批準(zhǔn)

8、驗(yàn)證小組審閱所有結(jié)果及評(píng)價(jià)分析意見(jiàn)，同意驗(yàn)證結(jié)果，簽字并按此結(jié)論實(shí)施。浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司直接接種無(wú)菌檢查法驗(yàn)證報(bào)告一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)本公司所采用的直接接種無(wú)菌檢查法進(jìn)行分析驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于本 公司產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。二實(shí)驗(yàn)原理直接接種法是通過(guò)加入一定的抑菌中和劑，以方便而快捷地中和抑菌劑，消除抑菌作 用，從而消除抑菌作用對(duì)無(wú)菌檢查的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)對(duì)直接接種法所加入的抑菌劑的中和效果進(jìn)行驗(yàn)證，從而得 出直接接種法無(wú)菌檢驗(yàn)的有效性。三實(shí)驗(yàn)步驟1、.培養(yǎng)基的配制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基16.5g,加入500ml純化水，緩慢加熱使其完

9、全溶解。白色念球菌用的改良馬丁培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取改良馬丁培養(yǎng)基14.5g,加入500ml純化水，在加入6g瓊脂粉，加熱使其溶解。生抱梭菌用的流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基14.5g,加入500ml純化水，在加入6g瓊脂粉，加熱使其溶解。將上述配制好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋中115 C , 30min。2、供試品的制備創(chuàng)可貼供試品：將包裝好的創(chuàng)可貼打開，用剪刀將創(chuàng)可貼剪碎，放入 100ml pH7.0氯 化鈉一蛋白臍緩沖液中浸泡1小時(shí)，取水層作為供試品。無(wú)菌敷貼供試品：將包裝好的無(wú)菌敷貼打開，用剪刀將無(wú)菌敷貼剪碎，放入100mlpH7.0氯化鈉一蛋白月東緩沖液中浸泡1小時(shí)，取

10、水層作為供試品。3、供試菌液的制備：大腸埃希菌菌液：取經(jīng) 35c培養(yǎng)19小時(shí)的大腸埃希菌培養(yǎng)物1ml,加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約10-510-8之間，混勻備用。金黃色葡萄球菌菌液：取經(jīng)35c培養(yǎng)19h小時(shí)的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物1ml,加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約10-510-8之間，混勻備用。白色念球菌菌液：取經(jīng) 255c培養(yǎng)72小時(shí)的白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽 水4ml洗下抱子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，取 1ml力口 9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6, 混勻備用。生抱梭菌菌液：取經(jīng) 35 c培養(yǎng)18h的生抱梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml,加9ml生理鹽水，10

11、倍稀釋至10-6,混勻備用。4、分別取上述兩種供試品100ml,加入抑菌中和劑，接入w100cfu菌株（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念球菌及生抱梭菌分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），再接種到每種菌株所需的上述培養(yǎng)基中，作為實(shí)驗(yàn)樣品組。5、用0.1%的蛋白月東溶液代替供試品進(jìn)行同上步驟操作，作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照組。6、取與實(shí)驗(yàn)樣品組等量的供試品，加入與中和劑等量的生理鹽水，再同第4步操作，作為陰性對(duì)照組。7、取100ml 0.1%蛋白月東溶液，不加中和劑直接接種等量菌株，再接種到培養(yǎng)基上，作為 菌種活性檢查組。浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司8、將接種好的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及生抱梭菌培養(yǎng)溫

12、度為35 C,白色念球菌培養(yǎng)溫度為25.5 C,培養(yǎng)數(shù)天后，觀察并記錄菌落數(shù)。四實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù) /皿）NO:1供試品：創(chuàng)可貼實(shí)驗(yàn)時(shí)間:2驗(yàn)組名 檢驗(yàn)菌而實(shí)驗(yàn)樣品組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球 菌12345平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人:日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿）NO:2供試品：創(chuàng)可貼實(shí)驗(yàn)時(shí)間：一試驗(yàn)組名菌種 實(shí)驗(yàn)樣品組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球國(guó)123

13、45平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人：日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿）NO:3供試品：創(chuàng)可貼實(shí)驗(yàn)時(shí)間:一試驗(yàn)組名菌種 實(shí)驗(yàn)樣品組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球國(guó)12345平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人：日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿）NO:4供試品：無(wú)菌敷貼實(shí)驗(yàn)時(shí)間:一試驗(yàn)組名菌種 實(shí)驗(yàn)樣品組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球國(guó)12345平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人：日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿）NO:5供試品：無(wú)菌敷貼實(shí)驗(yàn)時(shí)間:一試驗(yàn)組名菌種 實(shí)驗(yàn)樣品組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組活性檢查組大腸埃希 菌12345平均金黃色葡 萄球菌12345平均白色念球國(guó)12345平均生抱梭菌12345平均結(jié)論：實(shí)驗(yàn)人：日期：年 月 日復(fù)核人：日期： 年 月 日10浙江紅雨醫(yī)藥用品有限公司無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（菌落數(shù)/皿