1、一把特殊的剪刀 限制性內(nèi)切酶1云南大學(xué)DNA體外重組酶切基因克隆的第一步是將目的基因分離出來(lái)，在體外進(jìn)行酶切（包括對(duì)目的基因和載體），然后再進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得重組的雜合分子，最后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，進(jìn)行擴(kuò)增或者表達(dá)，或者其它的分子生物學(xué)研究。基因工程的步驟酶切作用主要是依靠限制性內(nèi)切酶的作用。2云南大學(xué)基因克隆示意圖3云南大學(xué)DNA體外重組酶切限制性內(nèi)切酶（restrictive endonuclease)的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)的宿主細(xì)胞的限制和修飾現(xiàn)象即k、 B高頻感染大腸桿菌菌株SK、SB 但是如果以KSB；或者以B SK，都會(huì)導(dǎo)致感染頻率下降數(shù)千倍；一旦KSB（或B SK）由B繁殖出的K

2、在第二輪接中便高頻感染SB，卻不能感染原有的SK。這一現(xiàn)象在原核生物中廣泛存在。4云南大學(xué)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)5云南大學(xué)DNA體外重組酶切7云南大學(xué)DNA體外重組酶切限制性內(nèi)切酶的分類(lèi) 目前為止，在細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了600多種限制性內(nèi)切酶，根據(jù)性質(zhì)不同分為三類(lèi)：I類(lèi) 研究最多的是大腸桿菌中的EcoK、EcoB，它們?yōu)楫愒炊嗑垠w。其識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)相距1000-5000bp，切割位點(diǎn)不表現(xiàn)嚴(yán)格的特異性；兩條鏈的斷裂需要ATP，且2條鏈上的斷裂位點(diǎn)相距70-75個(gè)核苷酸；II類(lèi) 多為小單體蛋白質(zhì)。識(shí)別序列具有特異性，且序列為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性，切割位點(diǎn)位于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列之內(nèi)，且雙鏈DNA切割不需要消耗

3、ATP。限制性內(nèi)切酶的功能和甲基化酶的功能分開(kāi)；這也是基因工程中常用的內(nèi)切酶；III類(lèi) 由R、MS亞基共同組成，其中MS亞基具有位點(diǎn)識(shí)別和甲基化修飾的雙重功能；R亞基具有內(nèi)切酶活性。切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)若干堿基對(duì)處，無(wú)序列特異性，而只與識(shí)別位點(diǎn)的距離有關(guān)，從7-26bp不等。該酶與DNA識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合嚴(yán)格依賴(lài)ATP。在與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合之后，修飾作用和限制作用取決于兩個(gè)亞基之間的競(jìng)爭(zhēng)。8云南大學(xué)DNA體外重組酶切II類(lèi)限制性內(nèi)切酶的基本特征II類(lèi)酶的發(fā)現(xiàn)：1968年，Smith等人在流感噬血桿菌d型菌株中發(fā)現(xiàn)該酶只是一種分子量較小的蛋白質(zhì)單體，其DNA的識(shí)別與切割活性僅需要 Mg2+，且識(shí)別

4、、切割位點(diǎn)具有嚴(yán)格特異性，因而在DNA重組和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛使用。命名：400余種II類(lèi)酶，鑒定的識(shí)別和切割位點(diǎn)有300多種，商品化100多種，DNA重組技術(shù)中常用的有20多種。其命名書(shū)寫(xiě)規(guī)則：以生物體屬名的第一個(gè)大寫(xiě)字母和種名的前2個(gè)小寫(xiě)字母構(gòu)成酶的基本名稱(chēng)；若酶在一個(gè)特殊菌株上發(fā)現(xiàn)，則將株名的第一個(gè)字母加在基本名稱(chēng)之后；若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還用一個(gè)大寫(xiě)字母表示這些非染色體的遺傳因子；酶最后的部分為羅馬字母，表明該生物發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。如HindIII 表明在Heamophilus influenzae d菌株種發(fā)現(xiàn)的第3種酶； EcoRI 表明在Escheri

5、chia coli的抗藥性R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)酶II類(lèi)酶的基本特性：既有特異的識(shí)別和切割位點(diǎn)；大多數(shù)II類(lèi)酶的2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA上的分布通常不是彼此直接相對(duì)的；因此斷裂的結(jié)果形成的DNA片段多是具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端10云南大學(xué)DNA體外重組酶切II類(lèi)酶的識(shí)別序列 識(shí)別序列為4-8個(gè)堿基對(duì)，且具有1800旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu) 如HindIII AAGCTT TTCGAA HapII CCGG GGCC Cfr13I GGNCC CCNGG Eco81I CCTNAGG GGANTCC Not I GCGGCCGC CGCCGGCG 正如上面所羅列的，一些II類(lèi)酶的識(shí)別序列中的某一或兩個(gè)堿基

6、并非嚴(yán)格專(zhuān)一，這種不專(zhuān)一性不影響內(nèi)切酶和甲基化酶的作用位點(diǎn)，只是增加了DNA分子上酶識(shí)別和作用的頻率。11云南大學(xué)DNA體外重組酶切切割方式：絕大多數(shù)II類(lèi)酶都是在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)DNA核苷酸，切割的位置可以在識(shí)別序列的任何二個(gè)堿基之間。根據(jù)被切開(kāi)的DNA末端性質(zhì)不同，所有的II類(lèi)酶可以分為： 5，突出末端酶 3，突出末端酶 平頭末端酶 其中前兩種情況下產(chǎn)生的2個(gè)突出末端在足夠低的溫度下可以退火互補(bǔ)，因此這些末端又稱(chēng)為粘性末端，這也是DNA重組技術(shù)中最常用的。12云南大學(xué)DNA體外重組酶切14云南大學(xué)DNA體外重組酶切由于識(shí)別以及切割方式所產(chǎn)生的幾個(gè)概念：同位酶： 識(shí)別相同的序列，但是其切割點(diǎn)不同的

7、不同來(lái)源的酶；同裂酶：識(shí)別序列和切割位點(diǎn)均相同的而來(lái)源不同的酶。同裂酶的用途：有的同裂酶對(duì)于切割位點(diǎn)的甲基化堿基的敏感程度有所差別，故可以來(lái)研究DNA的甲基化水平。如：HpaII和MspI是一對(duì)同裂酶，識(shí)別的序列均為：CCGG，但是若CC*GG，HpaII則不能切割，而MspI仍可以進(jìn)行切割；同尾酶：有些來(lái)源不同的酶盡管其識(shí)別的序列不同，但是其切割出的DNA片段是有相同的粘性末端。因此由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可以通過(guò)相同的粘性末端連接起來(lái)，但是這樣產(chǎn)生的雜合位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。（也有少數(shù)例外的，如Sau3AI和BamHI是一對(duì)同尾酶，其形成的雜合位點(diǎn)仍然可以被Sau3AI

8、切割）15云南大學(xué)DNA體外重組酶切17云南大學(xué)DNA體外重組酶切甲基化酶許多II類(lèi)限制性內(nèi)切酶都具有相應(yīng)的甲基化酶伙伴。這些甲基化酶識(shí)別序列與限制性內(nèi)切酶相同，并在識(shí)別序列中使某位堿基發(fā)生甲基化，從而封閉酶的切口.(也有例外，有的限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化修飾并不敏感）命名：對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶名字前面冠以M。如M. EcoRI18云南大學(xué)DNA體外重組酶切甲基化酶的種類(lèi)：大腸桿菌中一般存在兩種甲基化酶，即DNA腺嘌呤甲基化酶Dam；和DNA胞嘧啶甲基化酶Dcm。這兩類(lèi)酶本身沒(méi)有限制性內(nèi)切酶的活性。其中Dam可以在5，GATC3，中腺嘌呤N6位置上引入甲基基團(tuán)，而Dcm則在序列5，CCAGG3，或5

9、，CCTGG3，的胞嘧啶C5位置上引入甲基基團(tuán)，使得從大腸桿菌中提取的DNA不能被某些限制性內(nèi)切酶切開(kāi)。19云南大學(xué)Dam敏感酶序列Dcm敏感酶序列Bcl ITGATCAAva IIGGT(A)CCA(T)GGCla IGATCGATCEcoR II CCAGGHph I GGTGATCSau96I GGNCCA(T)GGMbo I GATCStu I AGGCCTGGMbo IIGAAGATCNru I GATCGCGATaq IGATCGAXba I TCTAGATC值得注意的是某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列本身不含有完整的Dam或Dcm甲基化酶識(shí)別序列，但在其左右兩側(cè)的核苷酸也許構(gòu)成了完整的

10、甲基化酶識(shí)別序列。20云南大學(xué)DNA體外重組酶切影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：酶活定義：指在最適反應(yīng)條件下（因酶而異，包括最適反應(yīng)溫度，最適緩沖條件），經(jīng)過(guò)1小時(shí)反應(yīng)將1ugDNA完全分解所需要的酶量，稱(chēng)為酶活單位；影響酶活的因素：DNA的純度：限制性內(nèi)切酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，很大程度上取決于所使用DNA本身的純度，而DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA以及SDS等都可以抑制酶的活性。如果DNA純度不夠，可以采用擴(kuò)大反應(yīng)體系來(lái)稀釋雜質(zhì)含量；DNA的甲基化程度：在野生菌株中存在兩種甲基化酶，一種是dam甲基化酶，使識(shí)別序列中的A甲基化；另一種使dcm甲基化酶，使識(shí)別序列

11、中的C甲基化。如果質(zhì)粒或其他的DNA從這種野生菌株分離出來(lái)，那么對(duì)甲基化作用敏感的限制性內(nèi)切酶就只能部分消化DNA，甚至根本不發(fā)生作用；酶切消化的反應(yīng)溫度：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37，也存在許多例外條件，如BamHI30,AccIII60;21云南大學(xué)DNA體外重組酶切DNA分子的結(jié)構(gòu)：DNA分子不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。如某些限制性內(nèi)切酶切割超螺旋DNA或病毒DNA所需要的酶量比消化線性DNA高出許多倍，甚至20倍；緩沖體系：絕大多數(shù)II類(lèi)酶對(duì)基本緩沖系統(tǒng)的組成要求相同，包括：10-50mmol/L的Tris-HCl（pH7.5） 使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所

12、需要的最佳數(shù)值范圍內(nèi)；10mmol/L MgCl2 酶活性的正常發(fā)揮絕對(duì)需要2價(jià)陽(yáng)離子，通常是Mg+；1mmol/L DTT 穩(wěn)定酶的空間結(jié)構(gòu)從而穩(wěn)定酶的活性；NaCl濃度不等 維持緩沖體系的鹽濃度，這對(duì)酶活性有很大的影響； 低鹽組： 0-5mmol/L NaCl 中鹽組： 50-100mmol/L NaCl 高鹽組： 100-150mmol/L NaCl 鹽濃度的過(guò)高或過(guò)低均能導(dǎo)致酶活的大幅下降。22云南大學(xué)24云南大學(xué)DNA體外重組酶切酶的星號(hào)活性：限制酶在一定的條件下使用時(shí)，對(duì)底物DNA的特異性可能降低，即可以將與原有識(shí)別的特定的DNA序列不同的堿基序列進(jìn)行切割，稱(chēng)為限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活性。星號(hào)活性的