1、免疫組化方法研究女性胎兒尿道括約肌的神經(jīng)支配【摘要】目的討論支配女性尿道括約肌神經(jīng)纖維的定位、定量及定性。方法12例21周至40周的女性胎兒尿道，分別進展石蠟包埋、膽堿乙酰基轉移酶(hlineaetylatransferase,HAT)及神經(jīng)肽Y(neurpeptideY,NPY)免疫組化染色，并對其結果進展半定量和定量分析。結果從尿道內口至外口，神經(jīng)肽Y陽性區(qū)域顯色范圍逐漸變孝強度減弱，膽堿乙酰基轉移酶陽性區(qū)域主要位于尿道中三分之一，統(tǒng)計學上具有顯著性差異。結論尿道括約肌的膽堿乙酰基轉移酶及神經(jīng)肽Y免疫組化染色對理解參與控尿的尿道括約肌神經(jīng)支配提供了很有價值的幫助。【關鍵詞】控尿神經(jīng)支配尿道

2、括約肌免疫組織化學InnervatinfthefealehuanfetusurethralsphinterbyiunhistheialstudiesABSTRAT:bjetiveTexplrethelatin,quantityandnaturefnervefibersinnervatingtheurethralsphinter.ethdsUrethraf12fealehuanfetusesbeteen21and40eeksfgestatineretreatedbyparaffinebeddedithhlineaetylatransferase(HAT)andneurpeptideY(NPY)i

3、unhistheialstaining.Thestainingresultsereanalyzedquantitativelyandseiquantitatively.ResultsFrtheurethrainternalrifietexternalrifie,thepsitivereginfNPYbeaesallerandthedensitythinner;thepsitivereginfHATasainlylatedintheiddlepartfarethra,andthereasstatistiallysignifiantdifferenebeteenthe.nlusinTheiunhi

4、stheialstainingfhlineaetylatransferaseandneurpeptideYintheanatialstruturesftheurethralsphinterprvidesabetterunderstandingftheriginandnatureftheinnervatinpartiipatinginurinaryntinene.KEYRDS:urinaryntinene;innervatin;urethralsphinter;iunhistheitry女性尿道括約肌的內在機制是由平滑肌和橫紋肌成分組成，它們各自承受互相獨立的神經(jīng)支配，這些機制目前尚不非常清楚1

5、。大多數(shù)學者認為女性尿道括約肌是由來自陰部神經(jīng)(軀體神經(jīng))和盆叢(自主神經(jīng))的神經(jīng)纖維共同支配2，但有關女性尿道括約肌及其支配神經(jīng)準確的定位、定量及定性方面的研究在國內外報道較少。本實驗采用免疫組織化學染色及顯微圖像分析技術，對國人正常女性胎兒尿道的膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)進展定位、定量研究，從而討論它們在控尿方面的作用。1資料與方法1.1資料選取12個正常女性胎兒，21-40周胎齡。測其冠臀長度為165-340，胎兒死亡1h內完好取下尿道，尿道長度為9-15，另取成人新穎大腦皮質及腎上腺髓質標本做陽性對照，以上標本均經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋。我們應用12個21-40周胎齡的女性胎兒尿

6、道，是因為胎兒在妊娠15周時橫紋肌和平滑肌之間已顯示出明顯的區(qū)別3，這個階段的胎兒可以在肉眼下解剖，括約肌的根本類型已經(jīng)建立4。1.2試劑和儀器NPY多克隆抗體購自武漢博士德生物制藥，HAT多克隆抗體及AB檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術，Bigenexi6000全自動免疫組化染色系統(tǒng)由廣州新捷儀器消費，Quantiet970型顯微圖像分析儀產(chǎn)自英國劍橋儀器公司。1.3方法1.3.1制作切片將石蠟包埋的女性尿道標本從內口至外口做連續(xù)切片，片厚4，根據(jù)尿道長度平均分成8個截面，加之內、外口，每個截面各取2張切片，分別做HAT和NPY染色。1.5統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)用s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS1

7、1.5軟件包，兩樣本均數(shù)差異應用t檢驗，P0.05為差異有顯著性。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2結果觀察21-40周女性胎兒尿道的組成，可見胎兒尿道已具有三層根本構造，發(fā)育良好：內層為充滿皺折的黏膜，中間為黏膜下血管組織，外層為纖維肌肉鞘，由平滑肌和橫紋肌彈性組織組成。2.1腎上腺素能神經(jīng)的分布NPY免疫組化染色分析提示，交感神經(jīng)介質NPY免疫組化陽性纖維呈棕黃色，多位于血管壁中層平滑肌細胞間和神經(jīng)束中，在局部細小動脈壁可觀察到較粗大的陽性纖維。從尿道內口至外口，NPY染色陽性區(qū)域(尿道平滑肌)逐漸變小，顏色變淺，至外口處幾乎完全消失(圖1)。將NPY免疫組化反響強度“0-3數(shù)字化后結果可見：近1/

8、3與遠1/3，中1/3與遠1/3之間差異均有顯著性(P0.01)，但近1/3與中1/3之間差異無顯著性(P0.05，表1)。圖112例女性胎兒尿道免疫組化染色分析(半定量)略2.2膽堿能神經(jīng)的分布從HAT免疫組化反響染色分析可見女性胎兒尿道的中間1/3染色最強，近端1/3次之，遠端1/3最弱。將HAT免疫組化反響強度“0-3數(shù)字化后結果可見：遠、中、近端三者差異均具有顯著性(P0.01，表1)，在膀胱頸部和尿道近1/3橫紋肌纖維很少。表1女性尿道NPY與HAT免疫組化分析結果略注：近1/3是指圖1中從內口至2；中1/3是圖1中從3至5；遠1/3是圖1中從6至8.與遠1/3比擬*P0.01；與中

9、1/3比擬P0.013討論關于此項研究內容，國外的研究結果并不完全相符，甚至結論互相矛盾。女性尿道的復雜構造組成了混合的神經(jīng)支配：自主神經(jīng)支配平滑肌，軀體神經(jīng)支配橫紋肌，自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)支配黏膜和黏膜下組織。平滑肌和橫紋肌的連接也非常嚴密，使得識別支配每種肌肉構造的神經(jīng)纖維變得非常困難5。女性尿道的尿道內括約肌主要由交感、副交感神經(jīng)支配，尿道外括約肌主要由軀體神經(jīng)支配，其中交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)節(jié)前纖維為腎上腺素能神經(jīng)，副交感神經(jīng)節(jié)后纖維和軀體神經(jīng)為膽堿能神經(jīng)，其神經(jīng)纖維末稍釋放乙酰膽堿，作用于尿道外括約肌的N型膽堿能受體，引起該肌收縮，阻止尿液排出。乙酰膽堿作為神經(jīng)遞質，作用于靶受體發(fā)揮作用

10、。膽堿乙酰基轉移酶是膽堿能神經(jīng)元的標志酶，是乙酰膽堿的合成酶，分布在膽堿能神經(jīng)元和纖維內；腎上腺素能神經(jīng)釋放單胺類遞質，故可以用顯示單胺類遞質的方法來研究腎上腺素能神經(jīng)纖維的分布，神經(jīng)肽Y(NPY)是腎上腺素能神經(jīng)的標志性神經(jīng)肽。應用免疫組化染色來研究兩種神經(jīng)遞質含量的多少，可說明神經(jīng)的興奮性上下，能充分反映神經(jīng)的功能,是理解膽堿能、腎上腺素能神經(jīng)及其所支配器官的重要方法。本實驗研究對尿道肌肉組織進展組織學和免疫組織化學分析顯示，在女性胎兒尿道的膀胱頸及近端三分之一，橫紋肌纖維相對較少，這與Brirakhanyavat等6的觀點相矛盾，他們發(fā)現(xiàn)胎兒的橫紋肌纖維出如今尿道的近端及中間三分之一處，

11、認為胎兒尿道的橫紋括約肌向近端延伸，這些纖維在后側外表是不完好的。Stlzenburg等7認為女性膀胱逼尿肌止于尿道內口，與尿道無任何延續(xù)，尿道平滑肌的內縱肌在近端三分之一開場變薄，遠端三分之二逐漸消失，外縱肌多數(shù)在尿道內口處消失，中間環(huán)形肌那么在近端三分之一形成強大的環(huán)形平滑肌括約跡本實驗經(jīng)過平滑肌標志性抗體(NPY)免疫組織化學染色證實，該括約肌向遠端尿道逐漸減少，開場減少處恰好為橫紋括約肌可檢測的部位。在中間三分之一尿道平滑肌和橫紋括約肌環(huán)繞整個尿道，平滑肌在尿道遠端三分之一處消失。橫紋括約肌開場于尿道近端三分之一的遠端，位于平滑肌的外側，向遠端逐漸增厚。本實驗研究還從HAT及NPY免疫組化染色分析中發(fā)現(xiàn)女性胎兒尿道的中間1/3染色最強，在女性胎兒尿道的平滑肌與橫紋括約肌之間并沒有明顯的界限，在尿道中三分之一處可清楚地看到平滑肌和橫紋肌纖維互相交織分布，逐漸過渡，形成所謂的尿道括約肌復合體，是女性重要的控尿機制。StEin等8通過尿動力學檢查發(fā)現(xiàn)，女性患者全膀胱切除術后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠橫紋括約肌，雖然尿道長度縮短了1.3，最大尿道壓下降12H2，卻仍能有效地控制排尿。Rther等9認為女性尿道的平滑肌具有括約肌作用，主要在持續(xù)控尿過程中發(fā)揮作用，可以控制尿道的關閉。橫紋括約肌可以隨意中斷排尿、對抗壓力性尿失禁，橫紋括約肌在中間三分之一處最厚并且