1、乳與乳制品病原微生物檢驗方法單增李斯特菌的檢驗 YLNB 4.61. 儀器及器材1.1 恒溫培養箱：301、2411.2 恒溫水浴鍋：461。1.3 顯微鏡：101001.4 離心機：4000 r/min1.5 均質器或滅菌乳缽。1.6 滅菌平皿：直徑90mm。1.7 滅菌試管： 16mm160mm1.8 滅菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL刻度）。1.9 冰箱：041.10 錐形瓶：100mL、500mL。1.11 架盤藥物天平：0g500g,精確至0.5g。1.12 離心管：30mm300mm。1.13 滅菌注射器：11.14 單核細胞增生李斯特氏菌標準株。1

2、.15 馬紅球菌。1.16 小白鼠：16g18g。2. 培養基和試劑 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯(TSBYE)：見附錄A1。 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆瓊脂(TSAYE)：見附錄A2。 EB增菌液：見附錄A3。2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：見附錄A4。2.5 三糖鐵(TSI)瓊脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。2.6 SIM動力培養基：見附錄A5。2.7 血瓊脂：GB/T4789.28中4.6。2.8 改良的Mc Bride(MMA)瓊脂：見附錄A5。2.9 硝酸鹽培養基：GB/T 4789.28中3.17。2.10 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和VP試驗用)：GB/

3、T4789.28中3.4。2.11 糖發酵培養基：GB/T4789.28中3.2。2.12 過氧化氫酶試驗：GB/T4789.28中4.38。2.13 鹽酸吖啶黃(AcriflavineHCl)(Sigma)。2.14 萘啶酮酸鈉鹽(Naladixicacid)(Sigma)。3. 檢驗程序單核細胞增生李斯特氏菌檢驗程序如下：檢樣25g(ml)LB1增菌液225mlEB增菌液225ml30,48h 30,24hLB2增菌液225ml30,24h 選擇性培養基(MMA)30,2448h TSI瓊脂SIM動力培養基25 2d5d(傘狀) 30,24hTSA-YE培養基30,24h 溶血實驗MR-V

4、P實驗小鼠致病力實驗協同溶血實驗革蘭氏染色顯微鏡下觀察運動硝酸鹽還原實驗過氧化氫酶實驗甘露醇七葉苷鼠李糖木醇 4. 方法4.1 樣品的收集及處理無菌取樣品25g(mL)放滅菌均質器中加225mLEB和LB增菌液中，充分攪拌成均質。如不能及時檢驗，可暫存4冰箱。4.2 增菌培養EB增菌液放301培養48h，LB1增菌液225mL放301，培養24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。4.3 分離培養將EB增菌液和LB2二次增菌液分離于選擇培養基MMA瓊脂平板上，培養301 48h，挑選可疑菌落，用白熾燈45角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落為灰藍或藍色，小的圓形的菌落。4.4

5、選5個以上的上述可疑菌落接種三糖鐵(TSI)瓊脂和SIM動力培養基，培養于251，觀察是否有動力，且成傘狀或月芽狀生長。一般觀察27d，陽性者可做下一步鑒定。4.5 純培養將上述有動力、形成傘狀者并在三糖鐵瓊脂培基上層、下層的產酸而不產硫化氫的可疑培養物接種于胰酪胨大豆瓊脂培養基(TSAYE)上，做純培養供做以下鑒定。4.6 染色鏡檢將上述可疑純培養物做革蘭氏染色并做濕片檢查；李斯特氏菌為革蘭氏陽性小桿菌，大小為0.40.5m0.52.0m；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。4.7 生化特性將上述可疑菌做進一步的生化試驗，單核細胞增生李斯特氏菌的主

6、要生化特性及有關菌的區別見表1。表1單核細胞增生李斯特氏菌生化性狀與有關菌的區別菌種溶血反應 硝酸鹽還原 尿素酶 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七葉苷單核細胞增生李斯特氏菌+ - - +/+ - + - +綿羊李斯特氏菌+ - - +/+ - - - +英諾克李斯特氏菌 - - - +/+ - V - +威爾斯李斯特氏菌 - - - +/+ - V + +西爾李斯特氏菌 + - - +/+ - - + +格式李斯特氏菌 - - - +/+ + - - +默氏李斯特氏菌 - + - +/+ + V - +注：V反應不定；+陽性；-陰性。4.8 對小鼠的致病力試驗將符合上述特性的純培養物接種于

7、TSBYE中，在30培養24h，離心，濃縮，使濃縮液每毫升1010/mL個細菌，取0.5mL濃縮菌液注射小白鼠腹腔，35只，觀察小鼠死亡情況。致病株于25d內死亡。試驗時可用已知菌作對照。單核細胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌對小鼠有致病性。4.9 協同溶血試驗(cAMP)在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌(R.equi)，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，在30培養2448h，檢查平板中垂直接種點對溶血環的影響。靠近金黃色葡萄球菌接種點的單核細胞增生李斯特菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，而綿羊李斯特氏菌在馬紅球菌附近的溶血增強，有助于鑒別。附錄A 培養基(補

8、充件)A1含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉湯(TSBYE)A1.1成分胰胨17g多價胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g 蒸餾水1000mLA1.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調至pH7.27.4，分裝，121滅菌15min，備用。A2含0.6%酵母膏胰酪胨大豆瓊脂(TSAYE)A2.1成分胰胨17g多價胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g瓊脂15g蒸餾水1000mLA2.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調pH至7.27.4，分裝，121高壓滅菌,備用。A3EB增菌液A3.1成分胰胨17g多價胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5

9、g蒸餾水1000mL鹽酸吖啶黃15mg/L萘啶酮酸40mg/LA3.2制法除吖啶黃和萘啶酮酸外，其余成分加熱混合調pH至7.27.4，12115min高壓滅菌。使用前加吖啶黃溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此兩種成分要無菌配制或過濾除菌。A4李氏增菌肉湯(LB1，LB2)A4.1 成分胰胨5g多價胨5g酵母膏5g氯化鈉5g磷酸二氫鉀1.35g磷酸氫二鈉12g七葉苷1g蒸餾水1000mLA4.2制法將上述成分加熱溶解，調pH至7.27.4，分裝，12115min高壓滅菌。A4.2.1李氏I液(LB1)225mL中加入：1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制) 0.45mL1%吖啶黃(用滅菌蒸餾水配制)0.27mLA4.2.2李氏液(LB2)200mL中加入：1%萘啶酮酸 0.40mL1%吖啶黃 0.50mL無菌分裝于10mL大試管中。A5改良的Mc Bride瓊脂(MMA)A5.1成分胰胨5g多價胨5g牛肉膏3g葡萄糖1g氯化鈉5g磷酸氫二鈉1g苯乙醇2.5mL無水甘氨酸10g氯化鋰0.5g瓊脂15g蒸餾水1000mL