1、 9/15山銀花含量分析方法確認方案方案編號：JYYZFA- 09 - 00起草 日期審核 日期批準 日期上海松華藥業有限公司目 錄一、確認方案概述 3二、確認范圍和目的 3三、確認組織及分工 3四、確認進度計劃 4五、前期準備及確認相關支持 4六、確認方式 5七、確認實施項目及內容 5八、確認過程及結果詳見此方案配套驗證報告 11九、確認過程偏差 11十、再確認或驗證時間及建議 11十一、附件 11附件1參加人員會簽及驗證結論12附件2 驗證小組培訓記錄 13一、確認方案概述:傳統中藥飲片山銀花為中國藥典長期收載品種，幾次藥典修訂此品種的含量測定方法及實驗條件均未變動。采用HPLC-UV-E

2、LSD聯動測定山銀花中綠原酸 、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙的含量。根據GMP要求，企業應對變更后的檢驗方法進行方法確認，以確保檢驗數據準確、可靠。為了確保此檢驗條件的準確性和符合性特依據中國藥典分析技術檢測技術指南及藥品GMP指南、2015版中國藥典四部、一部相關部分要求結合上海市食品藥品檢驗所中藥室老師指導起草此確認方案。對檢驗方法進行確認，以確保產品質量。二、確認范圍和目的本方案適用于2015版中國藥典一部山銀花含量項下所涉及的相關內容。1.通過確認證明現行藥典所采用的方法適合于相應的檢測要求，保證該方法在我公司實驗室具有良好的適用性。2.確認公司所配備硬件、軟件即實驗儀器、設備及人員

3、符合并熟練撐握此實驗標準操作規程。3.確認過程應嚴格按照本方案規定的內容進行，若因特殊原因確需變更時，應填寫確認方案變更申請及批準，報驗證小組批準。三、確認組織及分工姓名部門確認分工李志勇質量部負責對確認中出現的問題提出指導意見，負責審核批準報告。韓子佩QA部負責審核確認方案、確認報告。劉潤雅QC部負責起草確認方案，協調確認試驗安排及實施，收集各項確認、試驗記錄，并起草確認報告。協助完成試驗徐婷、韓曉鳳QC部含量檢驗方法確認的實施。四、確認進度計劃2019年06月03日2019年06月30日五、前期準備及確認相關支持5.1方案培訓參與本次方法確認的人員均應過該方案的培訓，培訓記錄表見附件。5.

4、2文件資料（1）相關SOP文件資料方法確認所需文件序號文件名稱文件編號生效日期是/否現行版文件1島津高效液高效液相色譜儀標準操作程序是 否2CP124S電子天平標準操作程序是 否3Varian380-LC蒸發光散射器標準操作程序是 否4金銀花露檢驗操作檢驗規程是 否（2）所有與確認有關的儀器、儀表、計量器具應進行過校驗，并達到合格要求。儀器儀表檢定記錄序號儀器型號/名稱儀器編號校驗日期是/否在有效期內1島津高效液相色譜儀是 否2Varian380-LC蒸發光散射器標準操作程序是 否3CP124S電子天平是 否4BT 25 S精密電子天平是 否5容量瓶（ ）是 否6移液管（ ）是 否（3） 對照

5、品、供試品及試劑及耗材信息名稱批號來源取用量對照品綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續斷忍冬皂苷乙供試品山銀花山銀花試劑乙腈乙酸甲醇色譜柱六、確認方式依據法規藥品GMP指南之分析方法驗證和確認要求，采用方式一進行：即，由兩名檢驗人員分別獨立對同一批產品（如必要用不同儀器）進行檢驗。比較兩人檢測關鍵項目及結果來證明方法在本實驗室的適用性。七、確認實施項目及內容7.1 確認前準備 7.1.1色譜條件與系統適用性試驗：7.1.1.1固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠。流動相：A相：乙腈 B相：0.4%醋酸溶液按下表進行梯度洗脫時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）01011.51588.5851012121818

6、301529293333458164716767557.1.1.2檢測條件：UV 綠原酸檢測波長：330nm。 ELSD 皂苷用蒸發光散射器檢測。7.1.1.3 理論板數：按綠原酸峰計算不低于1000。7.1.1.4 開啟儀器并按上述色譜條件及工作站界面要求進行各項參數設定與系統預平衡。7.1.2 對照品溶液配制： 精密稱取綠原酸對照品約12.5mg、含灰氈毛忍冬皂苷乙對照品約15mg，置25ml棕色量瓶中，另取川續斷皂苷乙對照品約10mg，置10ml棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，精密量取5ml至上上述25ml棕色量瓶中加50%甲醇定容，制成每1ml含綠原酸0.5mg、含灰氈毛忍冬皂

7、苷乙0.6mg和川續斷皂苷乙0.2mg的混合溶液，即得。7.1.3 供試品溶液配制： 取供試品粉末(過四號篩)0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率40kHz）40分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。7.1.4 計算公式1：綠原酸：y=ax+b 式中：y為對照品或樣品峰面積或峰高； x為對照品或樣品的進樣質量。公式2：兩皂苷：LgA=aLgC+b式中： A為對照品或樣品峰面積或峰高； 7.1.4 檢驗結果判定本品按干燥品計算，含綠原酸（C16H18O9）不少于2.0%,含灰氈毛忍冬皂苷乙

8、(C65H106O32) 和川續斷皂苷乙(C53H86O22)的總量不得少于5.0。即為符合規定。7.2專屬性確認分別精密量取陰性對照溶液、對照品溶液、及供試品溶液各10l，依次注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定。可接受標準： 1、HPLC：檢測波長330nm：供試品溶液中綠原酸保留時間與對照溶液中綠原酸峰保留時間一致。綠原酸峰理論塔板數不低于1000。2、ELSD陰性對照圖譜中無干擾色譜峰；對照品色譜與供試品色譜峰中灰氈毛忍冬皂苷乙峰與川續斷忍冬皂苷乙相應位置上無干擾色譜峰，且出峰保留時間一致。 表2綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙的專屬性結果 項目名稱 保留時間R第一人檢測結果

9、第二人檢測結果對照品樣品對照品樣品綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續斷忍冬皂苷乙結論匯總人/日期： 復核人/日期：7.3 準確度 （兩點法通過線性關系）考察7.3.1待系統平衡后將混合對照品溶液按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液2ul、|10ul,為一組數據；2ul、|10ul結合 4ul、|8ul,為第二組、分別進樣2針（可跟據驗證實際情況做合法調整），觀察測定各峰面積。繪制標準曲線，其中綠原酸以峰面積 Y對綠原酸對照品濃度 X進行線性回歸,而灰氈毛忍冬皂苷乙與川續斷皂苷乙則分別以峰面積 Y對相對應的對照品濃度 X的 log對數進行線性回歸。3個成分的線性方程見表 3。可接受標準：標準曲線線性良

10、好，且R20.999表 3綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙的線性方程：名稱第一人檢測第二人檢測檢驗員檢驗日期色譜柱信息實驗組別信息第一組第二組第一組第二組 檢測結果成分線性方程R2線性方程R2線性方程R2線性方程R2綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續斷忍冬皂苷乙結論產品批號： 匯總人/日期： 復核人/日期： 15/157.4精密度7. 4.1重復性精密吸取樣品溶液各510L,按上述色譜條件連續進樣 5次 ,測得綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙峰面積的記錄色譜圖RSD(n=5)實驗結果分別匯總附件）。可接受標準：5針主峰峰面積RSD不大于2%。ELSD主峰峰面積RSD不大于5%符合標準表明儀

11、器精密度良好， （由于ELSD檢測器性能所限如遇個別參數超標可視風險而判定）。名稱測定結果RSD12345平均綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續斷忍冬皂苷乙結論表4 含量精密度（重復性）測定結果匯總人/日期： 復核人/日期：7. 4.2中間精密度及穩定性由兩名實驗員在不同天，分別用同一批對品溶液及配制供試品溶液，按上述色譜條件，分別進樣分析，將實驗結果分別匯總相應附件。表5含量中間精密度測定結果供試品批號： 名稱第一人檢測第二人檢測檢驗員檢驗日期儀器編號色譜柱綠原酸灰氈毛+川續斷兩次相對平均偏差綠原酸灰+川結論匯總人/日期： 復核人/日期：7.4.3樣品測試（測試過程及實驗信息詳見配套報告）可接受標準

12、：按藥典山銀花項下標準判定其是否合格。7.4.3.1實驗樣品測試；選用確認批次山銀花YG05- 按現行藥典方法測試。7.4.3.2重現性測試；選用確認批次山銀花YG05- 按本方案確認方法委托第三方進行測試結果同本單位結果進行比對，證明儀器及方法的重性。7.5耐用性7.5.1應用HPLC-UV-ELSD法進行山銀花含量測定的方法學考察過程中，發現ELSD 檢測器的漂移管溫度和載氣流速對儀器的基線噪音和被測樣品的響應值影響較大，最佳的參數應該是可接受噪音的最低溫度和獲得最大檢測響應值的最低氣體流量。本試驗通過分別逐漸改變漂移管溫度和霧化器氣體流量，記錄峰面積的變化，選擇了最優的溫度和載氣氮氣的流速，漂移管溫度、載氣流量 確定最佳的實驗條件（見配套報告）。八、確認過程及結果詳見此方案配套驗證報告九、確認過程偏差在確認實施過程中發現的偏差必須進行記錄和分析（表6）。內容要包括：偏差的表現、查找引起偏差的原因及查找過程、偏差分析的結果、此偏差是否對驗證結論有影響、有何影響。偏差概述引起偏差的原因及查找過程偏差分析及解決方案糾正和預防結論確認人員/日期審核人員/日期批準人員/日期偏差調查處理報告（表6）十、再確認或驗證時間及建議10.1法定相關檢查標準修改后需要對本方法重新進行驗證或確認；10.2檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢驗方法應重新驗證。十一、附件 11.1相關實驗