1、Word文檔 蛋白質組學的樣品制備 想要討論蛋白質，首先要得到高度純化且具有生物活性的目的物質，因此，蛋白樣品的制備是重要前提。蛋白提取的質量和效果對后續的討論分析有重要影響。不同種類的樣本在制備過程中，存在一些差異，要依據樣本特征調整試驗方案和操作細節。 基本原則樣品處理盡量簡潔，削減蛋白損失；盡量避開蛋白的降解；盡可能提高樣品蛋白的溶解度；防止溶液介質中對蛋白質的人為修飾；去除非蛋白雜質。制備過程蛋白質的制備一般要經過以下四個階段：選擇材料和預處理，材料的破裂，提取和純化，濃縮、干燥和保存。由于蛋白種類繁多，性質差異較大，因此不行能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分別。依據性質進行分類，大

2、部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可采納不同溶劑提取、分別及純化蛋白質。制備原理蛋白質在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、 pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。溫度：多數蛋白質的溶解度隨著溫度的上升而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度上升會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采納低溫（5度以下）操作。pH：蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，

3、提取液的 pH值應選擇在偏離等電點兩側的 pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不行逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。離子強度：稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有愛護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性鹽，一般以 0.15 摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采納 0.02-0.05M 磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。提取蛋白質時常依據這些內外因素綜合加以利用，將細胞內蛋白質提取出來，并與其它不需要的物質分開。制備方法破裂的方法有

4、很多種，可歸納為：機械法（超聲波法、機械勻漿法、液氮研磨法和玻璃珠破裂法），化學法（去污劑法、酶裂解法、），物理法（循環凍融法、滲透法、高壓法）。這些方法有不同的應用范圍，基本的原則都是要以最小的限度削減蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破裂這一步的關鍵所在。而常用的方法有：超聲波法、機械勻漿法、液氮研磨法、鹽析、沉淀法。其中，有機溶劑沉淀法使用較為普遍，常用的有機溶劑有丙酮、苯/酚等。冷丙酮沉淀丙酮和苯/酚沉淀法留意事項：1.冷丙酮沉淀的時間與溫度。常溫或升溫時，蛋白立體結構綻開，丙酮極簡單與其中的色/氨酸、酪/氨酸等氨基酸進行疏水結舍導致蛋白變性，所以我們通常預冷丙酮并且

5、低溫操作。2.超聲功率和時間，重在觀看超聲后樣品溶性的勻稱度。3.一般和三氯/乙酸一起使用，效果更好。4.還原烷基化。苯/酚提取1.各種試劑的正確及精確配制。（如：煎糖提取液）2.加入飽和酚后要充分震蕩和離心。（使蛋白充分與酚、色素H鍵結合，讓其分三層）3.需純化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯/酚等雜質）留意事項1.在蛋白質制備過程中使組織始終置于冰上，離心機、離心管等儀器設備要提前預冷，以防蛋白質的降解。2. 要加入適量的裂解液，裂解肯定要充分，勻稱。3. 植物和動物組織樣本一般采納研磨或勻漿機破裂處理，細胞和菌體樣本一般采納超聲破裂，破裂過程中要避開材料的溶化。4. 對預處理好的材料，若