1、關于菌種的制備和保藏1第一張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月2第一節 微生物的生長繁殖第二張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月3生長微生物細胞吸收營養物質，進行新陳代謝，當同化作用異化作用時，生命個體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖生命個體生長到一定階段，通過特定方式產生新的生命個體，即引起生命個體數量增加的生物學過程。發育從生長到繁殖，是生物的構造和機能從簡單到復雜、 從量變到質變的發展變化過程，這一過程稱為發育。個體生長微生物細胞個體吸收營養物質，進行新陳代謝，原生質與細胞組分的增加為個體生長。群體生長群體中個體數目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個

2、體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況）個體生長個體繁殖 群體生長 群體生長 = 個體生長 + 個體繁殖一、生長與繁殖的概念第三張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月4二、細菌的繁殖一般為無性繁殖，二分裂法。同形裂殖：裂殖后形成的子細胞大小相等。異形裂殖：分裂產生兩個大小不等的子細胞。細菌分裂過程：菌體伸長，核質體分裂形成橫隔壁子細胞分離無性繁殖有性繁殖少數有菌毛的菌可進行有性繁殖方式第四張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月5三、放線菌的生長繁殖第五張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月6由分枝狀菌絲組成。菌絲無隔膜，仍屬單細胞。菌絲直徑與桿菌相似（1 m左右）；細胞壁含磷

3、壁酸、二氨基庚二酸，不含幾丁質、纖維素；革蘭氏陰性。1、放線菌的形態構造菌絲根據形態和功能不同可分為： 基內菌絲(Substrate mycelium） 氣生菌絲(Aerial mycelium) 孢子絲(Reproductive mycelium)第六張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月72、放線菌的繁殖方式第七張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月8四霉菌的繁殖方式第八張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月9)：1.孢囊孢子（sporangiospore）形成特征：形成于菌絲的特化結構孢子囊內。孢子形態：近圓形。舉例：根霉、毛霉。第九張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月

4、102.分生孢子(Canidinm):形成特征：由分生孢子梗頂端細胞特化而成的單個或簇生的孢子。孢子形態：極多樣。舉例：曲霉、青霉。第十張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月113.節孢子(arthrospore，又稱粉孢子)形成特征：由菌絲斷裂而成。孢子形態：常呈成串短柱狀。舉例：白地霉。第十一張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月12厚垣孢子4.厚垣孢子（Chlamydospore)形成特征：部分菌絲細胞質濃縮、變圓，周圍生出厚壁而成。孢子形態：圓形、柱形等。舉例：總狀毛霉。第十二張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月13有性結構及其形態特征：由大小不同的配子囊結合后發育而成。

5、 小配子囊稱雄器；大配子囊稱藏卵器。所屬分類地位：卵菌綱。1. 卵孢子（oospore)第十三張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月142. 接合孢子（zygospore):有性結構及其形態特征： 是由菌絲生出的結構大小相似、形態相同或略有不同兩個配子囊接合后發育而成。 所屬分類地位：接合菌綱接合孢子形成過程:第十四張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月153.子囊孢子（ascospore):有性結構及其形態特征：在子囊中形成。 子囊：兩性細胞接觸以后形成的囊狀結構。子囊的形成有兩種方式： 兩個營養細胞直接交配而成，其外面無菌絲包裹； 從一個特殊的、來自產囊體菌絲（稱為產囊絲）的結構上

6、產生子囊，多個子囊外面被菌絲包圍形成子實體，稱為子囊果。所屬分類地位：子囊菌綱第十五張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月164.擔孢子(basidiospore)有性結構及其形態特征：擔子菌所特有，經兩性細胞核配合后產生的外生孢子。因著生在擔子上而得名。所屬分類地位：擔子菌綱第十六張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月17五、微生物生長的測定方法描述不同種類、不同生長狀態的微生物生長情況，需選用不同的測定指標。（一）微生物細胞數目的檢測法直接法（血球計數板、比例計數法）間接法（活菌計數法、液體稀釋法、膜過濾法）（二）微生物生長量和生理指標測定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法

7、，碳、氮含量法，其它生理指標）第十七張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月181.涂片染色法應用：可同時計數不同微生物的菌數，適 于土壤、牛奶中細菌計數。 方法：用鏡臺測微尺計算出視野面積；取 0.01ml菌液涂于1cm2面積上，計數后代 入公式： 每ml原菌液含菌數 = 視野中平均菌數涂布面積/視野面積100 稀釋倍數第十八張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月19原理：將1cm20.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數其中的細胞數目，換算成單位體積中的細胞數。適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞，因為（1

8、）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區分死活細胞。2.血球計數板法第十九張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月202.血球計數板法第二十張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月213.比濁法原理是在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。特點：快速、簡便；但易受干擾。第二十一張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月224.平板菌落計數法技術要求：樣品充分混勻

9、，操作熟練快速（1520min完成操作），嚴格無菌操作；注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養瓊脂上生長的微生物，誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內菌體分布不均勻、以及不當操作A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported

10、 as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.第二十二張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月234.平板菌落計數法第二十三張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月24六、微生物的群體生長無分支單細胞微生物主要包括細菌和酵母菌，其群體生長是以群體中細胞數量的增加來表示的， 由一個細胞分裂成為兩個細胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（eneration time, G ），代時也就是群體細胞數目擴大一倍所需 時間，有時也稱為倍增時間。右圖表示的是一個細胞經過

11、若干代分裂后的情況。右圖可見，每經過一個代時，細胞數目就增加一倍，呈指數增加，因而被稱為指數生長，這就是單細胞群體生長的特征。1.無分支單細胞微生物的群體生長特征第二十四張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月25將少量單細胞的純培養，接種到一恒定容積的新鮮液體培養基中，在適宜條件下培養，每隔一定時間取樣，測菌細胞數目。以培養時間為橫坐標，以細菌增長數目的對數為縱坐標，繪制所得的曲線。生長曲線的制作第二十五張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月26典型的生長曲線 （Growth curve）延滯期對數期穩定期衰亡期時期的劃分：按照生長速率常數（growth race constant）不

12、同第二十六張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月27其它名稱：停滯期、調整期、適應期1.現象：活菌數沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點：生長速率常數= 0細胞形態變大或增長細胞內RNA特別是rRNA含量增高，原生質嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產生誘導酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學藥物）3.原因：適應新的環境條件，合成新的酶，積累必要的中間產物.延滯期（lag phase）第二十七張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月28菌種 ： 繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；接種物菌齡 ： 用對數生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到

13、延遲期；接種量：一般來說， 接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發酵工業上一般采用1/10的接種量）；培養基成分： 在營養成分豐富的天然培養基上生長的延滯期比在合成培養基上生長時短；接種后培養基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發酵工業上盡量使發酵培養基的成分與種子培養基接近。影響延遲期長短的因素：第二十八張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月29認識延遲期的特點及形成原因對實踐的指導意義：在發酵工業上需設法盡量縮短延遲期；采取的縮短lag phase 的措施有：增加接種量； （群體優勢-適應性增強） 采用對數生長期的健壯菌種；調整培養基的成分，在種子基中加入發酵培養基的某些成分。選用繁殖

14、快的菌種在食品工業上，盡量在此期進行消毒或滅菌第二十九張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月30.對數期（logarithmic phase）其他名稱：指數期 現象：細胞數目以幾何級數增加，其對數與時間呈直線關系。 特點：生長速率常數最大，即代時最短細胞進行平衡生長，菌體大小、形態、生理特征等比較一致代謝最旺盛細胞對理化因素較敏感影響因素：菌種營養成分營養物濃度培養溫度第三十張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月31應用意義：由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產上用作接種的最佳菌齡；發酵工業上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度食品工業上盡量使有害微生物不能進入此期是生理

15、代謝及遺傳研究或進行染色、形態觀察等的良好材料。第三十一張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月32營養物濃度與對數期生長速率和產量作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內，可影響生長速率和菌體產量的營養物就稱生長限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長速度和最大收獲量受影響時間細胞數或菌體量第三十二張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月33. 穩定期（stationary phase）又稱：恒定期或最高生長期特點：新增殖的細胞數與老細

16、胞的死亡數幾乎相等，微生物的生長速率處于動態平衡，培養物中的細胞數目達到最高值。細胞分裂速度下降，開始積累內含物，產芽孢的細菌開始產芽孢。此時期的微生物開始合成次生代謝產物，對于發酵生產來說，一般在穩定期的后期產物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。產生原因： 營養物尤其是生長限制因子的耗盡 營養物的比例失調，如碳氮比不合適; 有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等） 物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適;第三十三張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月34應用意義：1）發酵生產形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產上應盡量延長此期，提高產量，措施如下： 補充營養物質（補料） 調pH 調整溫度 2

17、）穩定期細胞數目及產物積累達到最高。生長產量常數（Y，或生長得率，growth yield）：概念：表示微生物對基質利用效率的高低 Y=菌體干重/ 消耗營養物質的濃度 根據產量常數可確定微生物對營養物質的需要量 如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養物（葡萄 糖）10g。Y=x x0C0 C=x x0C0第三十四張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月35. 衰亡期（decline phase）特點：細胞死亡數增加，死亡數大大超過新增殖的細胞數，群體中的活菌數目急劇下降，出現“負生長”。細胞內顆粒更明顯，細胞出現多形態、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。因菌體本身產生的酶及代謝產物的作用，使

18、菌體死亡、自溶等，發生自溶的菌生長曲線表現為向下跌落的趨勢。 衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環境條件有關。產生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡第三十五張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月36lg 細胞數或產物濃度時間細胞 產物I型II型3.微生物生長與代謝產物形成的關系微生物發酵形成產物的過程與微生物細胞生長的過程并不總是一致的。一般認為：初級代謝是給予生物能量和生成中間產物的過程，初級代謝產物的形成往往與微生物細胞的形成過程同步，微生物生長的穩定期是這些產物的最佳收獲時機；次級代謝產物與微生物的生存、生長和繁殖無關。次級代

19、謝產物的形成往往與微生物細胞的形成過程不同步。在分批培養中，它們的形成高峰往往在微生物生長穩定期的后期或衰亡期。第三十六張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月37第二節 固體孢子制備 固體孢子是生產種子的一種形式?？股厣a中選用哪一種種子形式進罐完全取決于菌種的遺傳特性。一般繁殖能力強，孢子數量多的菌種可用固體孢子進罐。固體孢子進罐優于菌絲進罐。因為分生孢子處于半休眠狀態，細胞內的代謝活動降到最低點。進種子罐后，每個個體都從同一水平起步生長繁殖。因此可以取得同步生長或接近同步生長。后代菌絲繁殖也比較一致。進罐前的固體孢子如能在水中浸泡數小時，使進罐后有利于孢子發芽，更能取得同步生長的效果

20、。第三十七張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月38孢子的擴大繁殖可經過斜面培養基生長或谷物固體培養基生長，需視菌種特性和生產工藝的需要而定。種子采用固體孢子直接進種子罐的抗生素品種有青霉素、土霉素、四環素、麥迪霉素等。第三十八張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月39一、不同菌種的固體孢子制備工藝 以四環素生產菌種的斜面孢子制備為例。四環類抗生素產生菌的分生孢子繁殖迅速，孢子數量多。每支茄子瓶斜面的生長周期為34d，孢子總數為(50100)億以上。已能滿足進罐孢子數的要求。因此采用斜面孢子制成孢子懸液直接進罐的種子工藝。四環素生產菌種的固體孢子制備工藝如下。第三十九張，PPT共四十七

21、頁，創作于2022年6月40 1斜面培養基()麩皮3.2，(NH4)2HP04 0.015，MgS04 0.005，瓊脂2.2，KH2P04 0.0l，裝量60mL(每個茄子瓶)。 2斜面孢子培養接種斜面后于35恒溫室培養100h。培養室內的空氣濕度不得低于30，以保證菌絲和孢子的正常生長。第四十張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月41培養成熟的斜面孢子每瓶加無菌水4050mL，制成孢子懸液，合并在一個茄瓶中，裝上微孔針頭壓差接種法裝置，利用壓差將孢子液接種到種子罐內。接種數量為500億個孢子m3種子液。視斜面孢子量的多少，每罐批接種24個茄瓶斜面。生產備用的斜面孢子冷藏保存，保存期不超過一個月。第四十一張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月42二、影響固體孢子質量的因素和控制孢子質量的方法 1孢子質量的影響因素孢子質量的影響因素包括原材料質量、培養基配比、培養條件(如溫度、濕度、通氣量)，還有孢子發育階段、孢子數量等。固體孢子的質量控制主要是控制孢子生長在傳代的最佳階段。傳代的最佳階段也是菌種保藏的最佳階段。該段能最大限度地抵御環境的不利因素，使自身的遺傳物質少受外界條件的影響。第四十二張，PPT共四十七頁，創作于2022年6月43 2固體孢子