1、內質網相干的凋亡途徑在高三尖杉酯堿誘導MUTZ-1細胞凋亡歷程中的胡潔何冬花高良楊春虎蔡真【摘要】本研究探究高三尖杉酯堿(Hharringtnine,HHT)誘導人DS細胞株UTZ-1細胞凋亡的作用機制。以HHT處置懲罰骨髓增生非常綜合征細胞株UTZ-1DS-RAEB,用流式細胞術檢測細胞凋亡率，用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內鈣離子濃度和線粒體膜電位變革，應用RT-PR檢測HHT處置懲罰前后與內質網應激有關的基因HP,BIP,XBP1的表達環境。效果表白：0.05g/lHHT作用UTZ-1細胞的凋亡率隨著時間的延伸而增長，其差異具有統計學意義P0.01；激光共聚焦效果表現，0.05g/lHHT作

2、用后4小時胞漿內a2+濃度增高，12小時達岑嶺，厥后開始落落；HHT作用后線粒體膜電位連續落落；HP以及BIP,XBP1基因表達加強，12小時到達岑嶺，厥后開始落落。結論:HHT可以誘導DS細胞株UTZ-1凋亡，內質網相干的凋亡途徑在此中發揮了緊張的作用?！娟P鍵詞】高三尖杉酯堿；DS細胞株UTZ-1；細胞凋亡；內質網應激RlefEndplasiRetiuluPathayinApptsisfDSellsInduedbyHharringtnineKeyrdshharringtnine;UTZ-1ell;apptsis;ERstress骨髓增生非常綜合征DS是一組異質性的造血干細胞疾病，病理生理學改

3、變為造血前體細胞成熟停滯和過分增殖，易于向白血病轉化1,2,其發病和治療機制是如今臨床研究的熱門。高三尖杉酯堿(HHT)是我國自主研制樂成的高效抗白血病藥物3，臨床上用來治療DS獲得必然的療效，本研究組前期事情表白HHT重要通過誘導細胞凋亡發揮抗白血病作用4,我們進一步研究表白，在此歷程中內質網發揮了緊張的作用。質料和要領重要試劑HHT(1g/l)購自杭州民生藥廠，在利用之前用RPI1640RPI1640干粉購自Gib公司稀釋至所需濃度。Flu3/A購自美國Bitu公司，J-1購自Siga公司，Annexin-V/PI,it-traker,ER-traker購自leularprbe公司，鼠抗人

4、熒光二抗購自ellsignal公司。細胞造就人DS細胞系UTZ-1引自德國BraushEig細胞中央5;在5%2、37條件下,于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、100g/l鏈霉素的RPI1640造就液中造就傳代,實行用細胞均處于對數生恒久。細胞凋亡的測定接納流式細胞術舉行AnnexinV/PI雙標識表記標幟測定。取經HHT處置懲罰后的各組細胞，調解濃度為2.0105/l，參加AnnexinV/FIT5l和PI0.5l，室溫避光30分鐘，用PBS洗滌2次，用流式細胞儀檢測。細胞內鈣濃度變革的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測6網絡處置懲罰后的各組細胞，用奇怪造就液調解細胞密度為2106/l，參加fl

5、u3/A終濃度為5l/L,37下避光溫育35分鐘，Hanks液洗滌2次。用Laia-TSSP激光共聚焦掃描顯微鏡對細胞內鈣舉行檢測，引發波長為488n,發射光為527n。線粒體膜電勢變革的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測7J-1為一種特異性的陽離子熒光染料,可定位在線粒體膜上,其引發光為490n,單體發射光為527n,多聚體發射光為590n,其聚攏程度與膜電位成正比。當線粒體膜電位增高時,赤色熒光加強,赤色熒光和綠色熒光的比值可代表膜電位的凹凸。網絡差異處置懲罰組的細胞,用奇怪造就液調解細胞密度為2106/l，然后與10g/lJ-137負載30分鐘,PBS洗2次后用共聚焦顯微鏡檢測。以赤色熒光值與綠色

6、熒光值的比值的巨細來表現膜電位的凹凸。凋亡前因子HP基因、內質網未折疊卵白質基因BIP,XBP1RNA表達程度的RT-PR檢測引物：HP357bp上游5-AGTATTGTTT-TTTG-3，卑劣5-GGTGAGATTAATTGG-3；BIP(231bp)上游5-ATAGGTTATGTG-3；卑劣5-TTTTTTAT-3；XBP1(441bp)上游5-TTGTAGTTGAGAAAGG-3，卑劣5-GGGGTTGGTATATATGTGG-3；-atin(619bp)上游:5-GTGGTGGTGTGAA-3，卑劣:5-GTAGAGATTTGT-3。反響條件：943分鐘；9430秒;5830秒;724

7、5分鐘，共30個循環；72延伸10分鐘。PR產物用1.5%的凝膠電泳，紫外燈下不雅察并照相。統計學處置懲罰數據用SD表現,用SPSS12.0闡發，P0.05表現有統計學意義，P0.01表現有明顯意義。效果細胞凋亡流式細胞儀檢測效果0.05g/lHHT作用后0，6,12及24小時UTZ-1細胞的凋亡率別離為0.630.59，5.071.38，10.215.79，22.526.55，凋亡率隨著時間的延伸而增高，差異具有統計學意義P0.01(圖1A、B)。細胞內鈣離子濃度的改變0.05g/lHHT作用4小時后,UTZ-1造就細胞內綠色熒光強度即顯著增長，12小時達岑嶺，厥后開始落落。統計學闡發資料表

8、白,參加HHT后的UTZ-1造就細胞內的a2+i與空缺比擬組比擬有明顯性差異(P0.01)(表1，圖2)。Table1.Flu-3/AfluresenefUTZ-1ellstreatedithHHT(略)細胞膜電位的變革正常UTZ-1細胞的外貌大多呈勻稱的橙赤色,表現綠色熒光的細胞較少;而顛末HHT處置懲罰的細胞胞體增大、綠色熒光加強,表白細胞受到損傷其線粒體膜電位有所落落。HHT處置懲罰后細胞紅、綠熒光值的比值和正常比擬組比力4小時后開始落落，8小時后較為顯著，48小時后細胞凋亡測不出。統計學闡發表白0.05g/lHHT作用8小時后的UTZ-1造就細胞與空缺比擬組比擬差異具有明顯性意義(P0

9、.01)(表2，圖3)。Table2.Dynaihangefithndrialebraneptential()inUTZ-1ellstreatedithHHT(略)凋亡相干基因RT-PR效果UTZ-1細胞靜息狀態下內質網應激相干基因HP基因不表達，BIP,XBP1基因少量表達，0.050g/lHHT作用4小時后即開始表達加強，12小時達岑嶺，24小時表達量落落，48小時測不出，各組與空缺比擬組比擬力差異具有統計學意義P0.01(圖4A、B)。討論高三尖杉酯堿(HHT)是我國自主研制樂成的高效抗白血病藥物，重要通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用,其確切機制是如今研究的熱門。本實行應用流式細胞術檢測U

10、TZ-1細胞凋亡的產生，且HHT引起UTZ-1細胞凋亡是時間依靠性的。我們進一步研究創造內質網在其凋亡歷程中也發揮了緊張的作用。內質網相干細胞凋亡是差異于受體介導(TNFR,Fas)或線粒體介導DNA損傷的另一種新的細胞凋亡途徑。內質網與細胞凋亡相接洽表如今兩個方面；一是內質網對a2+的調控，二是內質網應激反響。大量實行表白，許多細胞在凋亡早期會出現胞質內a2+濃度敏捷連續的升高，這種濃度升高泉源于細胞外a2+的內流和胞內鈣庫如內質網的開釋。相對高濃度的a2+一方面可以激活胞質中的鈣依靠性卵白酶如鈣卵白酶alpain，另一方面可以作用于線粒體，影響其通透性的改變，進而促進凋亡9，10。本研究以

11、Flu-3/A為指示劑,接納激光掃描共聚焦顯微鏡法測定細胞內游離a2+,效果創造人UTZ-1細胞受HHT作用后4小時細胞內鈣熒光強度開始增長,8小時后增高更為明顯,12小時達岑嶺，厥后開始落落，但仍高于靜息狀態，表白HHT作用后出現鈣超載。本研究同時也以J-1作為指示劑，用激光掃描共聚焦顯微鏡法測定用藥前后細胞線粒體膜電位的改變，效果表現用藥后，線粒體膜電位連續落落。因此我們推測HHT作用于UTZ-1細胞，引起UTZ-1細胞內游離鈣離子的早期升高，但終極導致細胞內鈣庫耗竭，線粒體膜電位的連續落落，細胞凋亡產生。內質網內錯誤折疊卵白質聚攏就會導致內質網分子朋友基因表達激活，當未折疊卵白質過分聚攏釀成有毒性時就會觸發細胞凋亡。信號重要通過aspase-12下傳。鈣卵白激酶HP(/EBPhlgusprtEin)基因也到場內質網應激反響誘導細胞凋亡11-12。我們的效果表白，0.05